中文摘要：
背景：
有证据表明转移性结直肠癌（mCRC）具有较高水平的瘤内异质性。我们定量分析了KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的肿瘤异质性，以评估其潜在的临床意义。
患者与方法：
收集CAPRIGOIM研究中一线应用FOLFIRI+西妥昔单抗的KRAS第2外显子为野生型的转移性结直肠癌患者的肿瘤样本（n=），采用二代测序进行突变基因的定量评估。等位基因的突变频率根据肿瘤细胞含量进行标准化，假设体细胞突变通常影响一个等位基因，将肿瘤细胞中突变等位基因的频率乘以2得到异质性评分（HS）。因此，HS实际对应肿瘤细胞中携带特定突变的部分。
结果：
KRAS基因的HS范围为12~，均值为87.1，中位数为84.4。提示在大多数的结直肠癌中，大部分肿瘤细胞均携带KRAS基因突变。NRAS中得到类似结果：HS范围为5.5~.7，均值为.8，中位数为.1。相比之下，在BRAF（HS范围17.1~；均值54.8；中位数54.3）和PIK3CA（HS范围14.3~；均值59.5；中位数47.3）突变的情况下，肿瘤细胞中只有小部分携带等位基因突变。KRAS突变但HS33（低KRAS；n=10）和KRAS突变HS33（高KRAS；n=35）的患者治疗有效率分别为70%和45.7%；中位无进展生存时间分别为7.97和8.37个月。低KRAS的PIK3CA的突变比例高于高KRAS（6/10和8/35）。
结论：
通常大部分肿瘤细胞都携带KRAS和NRAS的基因突变，而仅有小部分携带BRAF和PIK3CA基因突变。低KRAS患者出现西妥昔单抗耐药可能由于一系列复杂的基因突变所致而不仅是KRAS突变量的变化。
专家点评
这是一项非常有意思的研究，是首次对KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA四种基因突变和mCRC抗EGFR单抗治疗疗效相关的基因突变进行异质性评价，进而判断其对治疗结局的影响。肿瘤异质性分为两种，一种是肿瘤间的异质性（inter-tumorheterogeneity），和不同的肿瘤类型相关；另一种是肿瘤内的异质性（intra-tumorheterogeneity），指的是在每一肿瘤组织内存在不同的克隆，因此也可存在不同的分子学异常，而往往是造成肿瘤原发或继发耐药的分子机制之一。本研究利用等位基因突变频率及其在肿瘤细胞占比的比值来测量肿瘤异质性，称之为异质性评分（HeterogeneityScore，HS），根据不同HS判断其对抗EGFR治疗疗效的影响。
在此研究中我们可以看到两个现象：第一是传统Sanger测序方法确定的KRAS基因2号外显子野生型患者中，利用更敏感的NGS方法仍然可以检测到近25%的KRAS突变，第二是HS33和33的患者相比，前者人群ORR更高，但其缓解优势并没有转换到PFS以及OS中。
这两种现象说明,目前临床实践中应用抗EGFR单抗过程中，存在几方面的问题值得思考：第一，临床常用筛选RAS和BRAF野生型患者的检测方法，如Sanger测序、焦磷酸盐测序和ARMS方法等，和灵敏度更高的NGS或者绝对定量的数字PCR检测如BEAMing、ddPCR等技术相比，传统方法能否把存在基因突变、从抗EGFR单抗治疗中疗效受到损害的患者排除，即排除“假阴性”患者；而在后者中如何设定合适的阈值，将具有低丰度突变而有可能获益的患者保留，即不会产生犯“假阳性”的错误；而低丰度或者如本文所定义的低HS的突变患者采用抗EGFR单抗治疗，是否真正地无法从治疗中获益，这点目前尚无定论。
第二，我们从该研究中发现，在KRAS基因2号外显子野生型的患者中，采用NGS检测能够多检测到高达78/（42.9%）存在上述四种基因至少一个突变，因此说明，采用更敏感方法能够检测出更多突变，而在抗EGFR治疗过程中，预先存在的突变在药物压力选择下，可能导致发生继发耐药，我们是否应排除此类患者？
第三，NGS检测到的异质性越强即高HS患者，ORR低于低HS患者，而发生耐药的时间两者似乎没有差别，说明只要肿瘤细胞内预先存在突变，就可能是发生耐药的原因，而不管突变形式是单一或者复杂性，异质性强弱与否。
尽管此研究说明mCRC患者中存在较高水平的肿瘤异质性，但是基于NGS技术的检测结果是否能改变目前临床实践，还需要更深入探索。
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