摘要
过去，探究微生物的功能主要依靠分离培养或标志物鉴定，而新兴功能驱动的单细胞基因组学通过微生物的功能或特征识别并捕获微生物个体。为了识别和表征参与纤维素降解的未培养微生物，作者开发了一种功能驱动的单细胞分选方法。该方法使用荧光标记的纤维素颗粒富集微生物，然后通过荧光激活细胞分选方法将结合了单个微生物的颗粒分选出来。通过大样本16SrRNA基因扩增子测序推断分选前微生物的群落组成。对分选后与纤维素颗粒结合的微生物进行全基因组扩增和鸟枪测序，然后进行系统发育定位。接下来，对可能的纤维素酶基因进行鉴定，使其表达并进行活性测试。作者在来自稀有生物圈的候选门——金细菌（Goldbacteria）的基因组中发现并验证了一种与众不同的纤维素酶的存在及活性。该基因组代表了一个种水平的生物体，被命名为Candidatus‘Cellulosimonasargentiregionis’。
编译：王丹蕊
英文标题：
Function-drivensingle-cellgenomicsuncoverscellulose-degradingbacteriafromtherarebiosphere
中文标题：
功能驱动的单细胞基因组学方法揭示稀有生物圈中的纤维素降解细菌
期刊：
ISME,
第一作者：
DevinF.R.Doud
RobertM.Bowers
通讯作者：
TanjaWoyke
作者单位：
U.S.DepartmentofEnergy,JointGenomeInstitute,WalnutCreek,CA,USA
前言
DNA测序成本的降低，流式细胞仪、成像技术和高通量质谱的进步为发现稀有微生物、研究其功能和酶的活性提供了新的机会。功能驱动基因组学（Function-drivengenomics），即通过各种方法富集功能类群然后对单细胞或细胞群的基因组进行测序，该方法提供了探索动态功能多样性的新途径。本文中，作者采用底物标记方法，结合单个颗粒分选和鸟枪法测序来鉴定热泉中的纤维素降解菌，然后构建纤维素降解菌的表达和活性图谱。为了测试该方法的选择性，作者比较了纤维素降解菌（Cytophagahutchinsonii和Clostridiumcellolyticum）和非纤维素降解菌大肠杆菌与底物结合的能力。从内华达州盖拉赫(Gerlach)GreatBoilingSpring(GBS)热泉中收集到了降解纤维素的微生物群体。该样品在三种不同的培养条件下进行了纤维素结合试验，然后对所有纤维素结合的颗粒进行鸟枪法测序。同时未经处理的群落进行扩增子测序，以评估培养富集程度。最后，从纤维素结合的微生物的基因组中鉴定出可能的纤维素酶基因并评估了它们的活性。其中金细菌是一种在稀有物种中发现的候选门，先前的研究对其知之甚少。
结果与讨论
01
荧光标记纤维素的基准测试
我们使用了降解纤维素的模式微生物C.hutchinsonii和C.ellollyticum对纤维素结合实验进行基准测试，这两种微生物分别能在好氧或厌氧条件下通过直接结合降解纤维素。我们用荧光素标记了Arbocel超细结晶纤维素(UFC)，并将标记的底物加入纯培养的细菌中，一些纤维素降解微生物会选择性与之结合。微生物带有红色荧光，纤维素颗粒带有绿色荧光。流式细胞术首先识别标记的纤维素颗粒，然后随着时间的推移识别被细菌结合的颗粒。
图1纤维素结合微生物的功能驱动单细胞基因组学。a.绿色荧光纤维素颗粒与红色荧光DNA染色微生物结合，从环境样品中分选出附着于纤维素的微生物。b.流式细胞术控制方法展示了随着时间的推移微生物与纤维素结合的情况。C.hutchinsonii(好氧纤维素降解菌)、C.cellulolyticum(厌氧纤维素降解菌)和大肠杆菌(非纤维素降解菌)的纯培养培养显示出与荧光标记纤维素结合的特异性。灭活C.hutchinsonii失去了结合纤维素颗粒的能力。c.GBS样品功能驱动的分选与测序实验概述。用16SrRNA基因扩增子序列测定了分选前的群落组成。加入标记的纤维素孵育后，纤维素-微生物结合的颗粒被单独鉴定并分选到孔板中。采用多重置换扩增方法（MDA）扩增全基因组，根据实时动力学对最佳扩增产物进行测序，得到单扩增基因组(SAGs)。在0、1和2个月的时间点，分别有59、50和48个纤维素-微生物颗粒检测到低cp值，测序共获得个纤维素-微生物结合颗粒的基因组信息。
02
捕获并表征GBS中与纤维素结合的微生物种群
本次研究中使用的热泉样品取自GBS地热田的一个水池，从普雷斯顿布朗洞(PBH)的水下池中采集。首先将标记的底物添加到样品中，立即分选获得未结合的基线。培养后，在标记的纤维素上检测到结合的微生物。接下来将纤维素-微生物结合颗粒收集到小管中，然后再将其分入孔板。PBH样本密封除氧，在黑暗条件下于50°C孵育，然后在1个月和2个月重复步骤（添加底物，孵育结合，然后分选），这两个样本都视作厌氧条件。实验总共获得个纤维素-微生物结合颗粒，并对其进行了基因组测序。其中个颗粒只包含一个一种有机体的序列，57个颗粒包含两个以上(少数三个)。按照平均核苷酸同一性将同种微生物的基因组被共同组装成CoSAG，以提高所得基因组的完整性。图2显示，能结合纤维素的微生物只占群落的一小部分。在门水平显著富集的包括Bacteroidetes,Ignavibacteria,Chloro?exi,Goldbacteria,Elusimicrobia,和Microgenomates。某一高度富集的拟杆菌门在群落中的相对丰度只有0.%，富集后增加倍。在厌氧条件下，Elusimmicrobia门的一种菌显著富集，两个时间点的平均富集倍数为倍，表明它对纤维素的亲和力，以及它在厌氧环境中增殖的能力。图2在0、1和2个月的时间点对从样品PBH中回收的SAG进行分类富集。绘制了原始大样本OTU的相对丰度和分选回收后SAG的相对丰度图。与分选回收的SAG匹配的原始样品OTU用彩色冲积图表示（门水平）。
表1功能驱动分选获得的高丰度成员与IMG收集的金细菌的宏基因组组装结果统计
图3基于56个保守标记基因的串联比对，将所有富集的SAG和CoSAGs在整个基因组树中的进行系统发育定位。细胞捕获的SAG由黑色枝表示，灰色枝来自IMG参考数据库。菱形表示至少存在一种有活性的纤维素酶；圆圈表示没有。气泡表示图2所示分类单元相对应的富集因子。Candidatus‘Cellulosimonasargentiregionis’的CoSAG和高度富集的共分选菌ElusimicrobiaGBS-CoSAG_05分别用紫色和橙色表示。仅将基因组完整性大于50%的中高质量的SAG和CoSAG基因组(表1)置于系统基因组学背景下研究，发现许多PBH基因组与纤维素降解者密切相关(图3)，从而预测了与纤维素结合的潜在机制。根据16SrRNA基因系统发育树，最新发现的微生物属于细菌候选门FCPU，CoSAG比对结果显示它是金细菌门下一个新的属。我们建议将该菌命名为Candidatus‘Cellulosimonasargentiregionis’。
03
从稀有生物圈中获得维生素降解候选门的特性
本共组装的Ca.‘C.argentiregionis’基因组序列大小为2.74Mb(完整度92.7%，污染率2.25%)，基于KEGG代谢通路判断其将纤维素降解为葡萄糖的可能性。另外收集了个MAG分析候选金细菌门的发育位置和保守特征。
图4基于金细菌基因组(GBSCoSAG_04)在单拷贝标记基因树中的位置及其近邻Firestonebacteria和Elusimmicrobia对该菌进行表征。
Ca.‘C.argentiregionis’基因组中有很多参与纤维素结合的碳水化合物结合组件(carbohydratebindingmodules，简称CBM)，大多数金细菌基因组中也存在糖苷水解酶（GH），这表明金细菌含有一系列碳水化合物活性酶，用于结合底物和解构。金细菌含有纤维素水解产物完整的下游利用途径，包括纤维二糖磷酸化酶、糖酵解和部分TCA循环，然而系统发育上最相近的Firestonebacteria和Elusimmicrobia并不具备。此外，Ca.‘C.argentiregionis’(GBSCoSAG_04)的纤维素酶与Hernsdorf的MAG中的高度相似，说明金细菌纤维素酶可能是通过水平基因转移产生的。
图5a.与NCBI非冗余数据库进行比对，构建了异源表达的金细菌纤维素酶及其系统发育学近邻的蛋白树。金细菌纤维素酶用红色表示，黄色星号表示来自Ca.celllosimonasargentiregionisGBSCoSAG_04(IMG基因组ID)的基因。b.三种蛋白质的活性测量。
为了评估金细菌的丰度和分布，从IMG/M获取了与Ca.‘C.argentiregionis’相似的16SrDNA。个基因组中只有46个与金细菌类似。这些16SrDNA序列来自多种环境，且相对丰度普遍较低，表明金细菌是GBS稀有生物圈的微生物。
04
纤维素酶的实验验证
在不含细胞的翻译体系中，使用还原糖释放的纳米结构启动质谱探究了总计70个候选纤维素酶的特征。有16种酶对木质纤维素衍生物有催化活性。除金细菌外，该方法得到的其他分类群都属于之前已知含有活性纤维素酶的门。70个候选纤维素酶中，21个属于Ca.‘C.argentiregionis’。它们都含有与纤维素解构有关的GH结构域，其中三个Ca.‘Arentiregionis’酶(Ga_、Ga_和Ga_)分解纤维素释放纤维二糖(Ga_也释放葡萄糖)，这三种酶都属于GH9内切葡聚糖酶家族。Ga_具有纤维素酶N端免疫球蛋白样结构域，Ga_和Ga_含有GH9结构域。系统发育研究表明，这三种酶与来自深层地下的金细菌MAG的纤维素酶一起形成了单系群。PBH中的金细菌纤维素酶可能具有独特的进化史，预示着该纤维素酶基因纤维杆菌基因的水平转移。
05
共分选的细胞
我们在单个纤维素颗粒的微尺度上获得了微生物活性和相互作用的信息。ElusimmicrobiaGBS-COSAG_05是PBH群落的一个低丰度成员(1%)，但在分选过程中富集了倍以上。先前研究发现Elusimmicrobia似乎是严格厌氧的肠道共生体，以葡糖糖为底物；而最近从沉积物样本和本研究的GBS样本中也发现了这种细菌。近80%的ElusimmicrobiaSAG与Ca.‘C.argentiregionis’在同一纤维素颗粒上共存，意味着两者间可能存在共生关系。但某些纤维素颗粒上它们是单独存在的，也可能是竞争底物的关系。
总结
通过对热泉群落进行针对性分选，作者获得了与纤维素有关的微生物的信息。虽然多数微生物相对丰度低于1%，但从该富集测序实验证明了功能驱动的单细胞基因组学方法的效果。分选试验在从快速反应的功能生态位中富集目标微生物方面具有高度的特异性，为解决纤维素降解问题提供了高度敏感又无需培养的方法。该方法从稀有物种种群中获得了大量Candidatus‘Cellulosimonasargentiregionis’及其高质量的共组装基因组草图，深入了解了金细菌门，并发现了可能导致金细菌在纤维素上生长的碳水化合物活性酶。通过新门微生物的富集提供了一种在单细胞水平上进行生物勘探的方法。最后，对基因组中纤维素酶编码基因的实验验证表明，功能驱动的单细胞基因组学也为鉴定稀有微生物中目标酶的活性提供了方法。将这种方法应用于其他底物，并将单细胞基因组学与先进的代谢物检测方法相结合，可以更深入地探究未培养环境微生物的原位功能。
参考文献：
Doud,D.F.R.,Bowers,R.M.,Schulz,F.,DeRaad,M.,Deng,K.,Tarver,A.etal.()Function-drivensingle-cellgenomicsuncoverscellulose-degradingbacteriafromtherarebiosphere.ISMEJ14:-.
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