NTRK基因NTRK1(染色体1q23.1)，NTRK2(染色体9q21.33)和NTRK3(染色体15q25.3)通常参与神经元的正常发育，编码原肌球蛋白受体激酶(TRK)蛋白，传统上分别称为TrkA，TrkB和TrkC。神经营养因子与TRK蛋白质结合后可诱导受体二聚体化、磷酸化并激活下游PI3K、RAS/MAPK/ERK和PLC-γ的信号级联通路。TRK信号通路的改变，包括基因融合、蛋白过度表达或单核苷酸改变，已经被发现是许多肿瘤的致病原因，特别是NTRK基因的融合，为目前最明确的致癌原因，被誉为“钻石突变”。
NTRK基因融合已在不同的成人和儿童肿瘤类型中被鉴定。这些融合是由于染色体间或染色体内的重排导致NTRK基因的3‘区(编码完整的激酶结构域)与伴侣基因的5’区(编码寡聚化或其他蛋白结合结构域)并列，最终产生具有结构性活性的TRK融合蛋白。还有报道涉及NTRK基因5‘区的融合，尽管这些融合具有致病性。然而，这些畸变在肿瘤发生中的作用还没有确定。NTRK融合在成人和小儿肿瘤中的分布和频率
虽然NTRK基因融合在最常见的肿瘤类型(如肺癌和结直肠癌)中很少见，但据报道，NTRK基因融合在一些罕见的肿瘤类型(如涎腺分泌性癌、乳腺分泌性癌、先天性中胚层肾瘤、儿童黑色素瘤和婴儿纤维肉瘤)中频发。据一项针对国人的儿童与成人软组织肿瘤携带NTRK基因融合的研究结果显示，纳入的例肉瘤病人包含58个肉瘤亚型，例儿童病人中有12例存在NTRK基因融合，比例为7.1%，瘤种为横纹肌肉瘤与纤维肉瘤；例成人中，12例存在NTRK基因融合，比例为2.8%，瘤种为横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、多形性未分化肉瘤（UPS)以及骨肉瘤。在这些NTRK融合阳性的肿瘤中，相当多的肿瘤同时表达S蛋白和CD34，其余的具有非特异性免疫表型。
NTRK基因重排和融合转录本可以通过不同的分子病理学技术如FISH、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和大规模平行测序(MPS)来检测，而TRK蛋白的表达可以通过免疫组化(IHC)来证实荧光原位杂交。FISHFISH在许多临床实验室都有，检测时间短，价格相对便宜；但是，需要特定的专业知识来解释测试结果，特别是在核切片可能会产生伪影的石蜡切片中。据报道，在儿童肉瘤中，FISH的假阴性率高达30%。此外，FISH不区分框内和框外融合事件。
免疫组织化学IHC通常使用与所有三种TRK蛋白(PAN-TRKIHC)的C-末端结构域共同的抗原结合的抗体来检测TRK蛋白表达的升高。这种方法依赖于这样一个事实，即大多数正常细胞表达低水平的TRK，而携带NTRK基因融合的肿瘤细胞通常显示高水平的TRK蛋白。然而，免疫组化检测到TrkA、TrkB和TrkC在一些正常细胞中有表达，这些细胞包括神经元、肌间神经丛、内皮细胞和足细胞。在成人组织中，表达仅限于平滑肌、睾丸和神经元成分。这些成分可用作内部(内皮细胞、肌间神经丛)或外部(肾组织中的足细胞)阳性的IHC对照。IHC是NTRK基因重排的一个有用的间接读数。然而，敏感性(75%-88%)和特异性(81%-96%)的不同比率已经被报道，可能是由于使用不同的抗体，不同的IHC检测方案，以及不良或过度的组织固定。这些变量中的任何一个都会影响IHC染色和强度。据报道，在一项免疫组化研究中，总的阳性预测值和阴性预测值分别为11.2%和99.8%(使用泛TRK抗体克隆EPR)。此外，敏感性因涉及的NTRK基因而异，NTRK3(55%-79%)的敏感性低于NTRK1(88%-96%)和NTRK2(89%-%)。当≥1染色时，TRKIHC信号应视为阳性。细胞核染色提示NTRK3融合，中到强的弥漫性胞浆染色提示NTRK1/NTRK2融合。与分子分析相比，IHC的一个优点是它提供了TRK抑制剂蛋白靶标表达的证据。在最初接受临床试验的55名患者中，6名对拉罗替尼具有原发耐药性的患者中，有3名患者的肿瘤材料可用于中心分析，在所有3名患者中，PAN-TRKIHC均未显示TRK蛋白表达升高，这表明分子检测检测到的重排在这些病例中没有产生具有完整TRKC末端的嵌合蛋白。另有一名患者携带NTRK3激酶结构域突变，从而产生抗药性。IHC在临床实验室中广泛使用，检测时间短，而且比FISH便宜得多。虽然需要更多关于敏感性和特异性的数据，但PAN-TRKIHC被认为具有10%的～假阴性率。在一项对7例软组织梭形细胞肿瘤和NTRK3重排同时由IHC和FISH检测到的患者的研究中，仅有3例重排通过RNA测序得以证实。因此，对于有很大可能含有NTRK融合但PAN-TRKIHC染色阴性的肉瘤，应考虑进行基因组学方法(FISH或MPS)的确证检测。IHC可能被证明是突出NTRK重排的有价值的筛查工具，但中枢神经系统和神经内分泌肿瘤除外，在这些肿瘤中，由于内源性TRK表达升高，IHC不是可靠的筛查工具。此外，许多肌源性或神经性分化的肉瘤可能显示局灶性TRK表达。因此，在这些肿瘤中，只有弥漫染色才应被认为是阳性。
RT-PCR
RT-PCR使用位于融合基因编码的转录本断裂区两侧的引物，其中3‘引物退火为NTRK基因，更多的5’引物退火为相应的融合伙伴基因。当存在于肿瘤中时，融合转录本的靶向部分将被扩增，产生阳性的RT-PCR结果。RT-PCR是一种广泛应用的技术，而且快速、廉价。多重RT-PCR可以在一次检测中使用针对多个已知NTRK融合基因的引物集进行。然而，这种方法不能检测到NTRK基因与未知配对基因的融合；因此，阴性的RT-PCR结果不能排除融合的存在。因此，只有在基于组织学的分诊后期望特定类型的融合的情况下，才推荐RT-PCR，例如，婴儿纤维肉瘤中的ETV6-NTRK3，或者作为FISH检测到的基因重排的补充方法。
大规模并行测序MPS允许同时检测NTRK1-3和任何数量的融合伙伴基因之间的融合，这取决于所使用的特定检测方法。用一组引物杂交以选择预定义基因中的区域的靶向MPS是首选的方法。基于DNA的MPS分析并不是鉴定所有NTRK融合的最佳方法，尤其是那些涉及NTRK2和NTRK3基因的融合，因为它们的内含子很大。靶向RNAMPS允许更系统地检测NTRK融合转录本。经过充分设计的靶向RNAMPS板可以检测到新的NTRK基因融合伙伴，并且有许多商业上可用的检测方法涵盖了所有这三种NTRK基因。然而，值得注意的是，不同的商业化验组在检测率方面有显著差异。55不是所有临床化验室都会定期进行MPS，周转时间相对较长，而且相当昂贵，特别是如果只需要进行有限数量的测试的话。然而，不同的研究小组正在继续开发RNAMPS平台，可以同时检测在肉瘤中观察到的大量融合基因。除了有功能的NTRK融合转录本，基于RNA的MPS分析还可以识别非致癌的异常NTRK重排(偶然的基因组改变)，这些重排不能产生具有构成活性的融合蛋白。临床医生应该意识到这种可能性，并了解如何解读复杂的MPS数据报告。如果融合蛋白的表达有疑问，IHC可能是一个有用的确证工具。同样，NTRK点突变比基因融合发生得更频繁，也可以通过MPS检测来鉴定；然而，这些突变不被认为是治疗反应的预测。
肉瘤中NTRK基因融合的检测鉴于TRK抑制剂在TRK融合肉瘤患者中表现出的强大疗效和良好的安全性，NTRK基因融合检测应纳入肉瘤患者的临床治疗，并在特定的阶段和亚型中优先考虑，如下所述。这些致癌驱动因素的稀缺性带来了许多挑战，包括测试成本、有限的资源、有限的肿瘤组织以及将新的分子测试整合到当前诊断工作中的复杂性。然而，分子检测在肉瘤患者的诊断和临床治疗中的总体益处已在大型多中心研究中得到证实，与肺癌的研究结果类似。虽然建议使用基于序列的检测方法(RNAMPS或RT-PCR)来检测有效的NTRK基因重排，但具有抗TRK蛋白抗体的IHC(最容易使用PAN-TRK抗体)可被用作一种快速、廉价的预筛选工具。此外，选择致病基因改变阴性的组织类型(其他易位、激酶突变、mdm2/cdk4扩增)可以排除45%的～肉瘤进行NTRK基因融合测试，因为这些驱动因素改变是相互排斥的。在TRK抑制剂治疗最相关的疾病环境中，NTRK融合测试可能是优先考虑的，同时考虑到最近报道的一些NTRK重排的实体倾向于表现惰性，大多数肉瘤患者在被诊断时仍是局部性的，这些肿瘤可以接受根治性手术切除，而不需要系统治疗。在未经治疗的肿瘤中，NTRK基因融合与其他驱动因素改变并存的情况非常罕见；然而，NTRK融合似乎在这些罕见的病例中发挥致癌优势。因此，在具有典型致病基因改变的肿瘤中进行NTRK融合检测可能是有价值的研究背景，以便提供关于共同发生NTRK基因融合的频率和临床意义的数据。虽然NTRK基因融合已经在一系列肉瘤亚型中被确定，但缺乏关于不同肉瘤亚型中NTRK融合频率的全面数据。因此，大多数软组织和骨肉瘤应该继续研究，直到有足够的数据来指导未来的诊断方法。综合不同肉瘤亚型的NTRK基因融合频率及其与形态学特征的相关性，将更好地为肉瘤NTRK基因融合筛选提供最佳途径，应予以收集。
TRK融合肉瘤的临床治疗拉罗曲尼(FDA和EMA)和恩曲替尼(FDA)的标签适应症包括那些手术可能导致严重并发症或没有令人满意的替代疗法的患者。因此，TRK抑制剂与其他可用的治疗方法相比的优缺点应该由患者和治疗医生来讨论。TRK抑制剂larotrectinib在成人和儿童TRK融合癌症中显示出显著的活性。一项小样本的前瞻性评价拉罗替尼用于携带TRK融合的儿童软组织肉瘤的新辅助治疗的疗效。共有5例患者(中位年龄2岁，范围0.4-12岁)为局部进展期婴幼儿纤维肉瘤(3例)或软组织肉瘤(2例)纳入研究。5例患者对拉罗替尼均有部分反应，中位治疗周期为6个周期(范围4-9个周期)，均接受手术切除。手术切除R0(切缘阴性，切缘无肿瘤)3例，R1(切缘显微残留肿瘤)1例，R2(切缘肉眼残留肿瘤)1例。3例患者获得完全(2例)或接近完全(98%的治疗有效；1例)病理反应。两名患者在手术切除时肿瘤存活，切除切缘呈阳性，继续接受拉洛替尼辅助治疗。无患者出现术后并发症或伤口愈合问题。这些结果支持评价拉洛替尼作为新诊断的TRK融合肉瘤儿童的术前治疗3名患者实现了完全或接近完全的病理反应，最后随访7-15个月仍无疾病。虽然这些数据令人鼓舞，但在完全反应后是否以及何时停止TRK抑制剂治疗的问题仍然存在。对于需要系统治疗的转移性疾病患者，在标准治疗失败后批准使用拉洛替尼或恩曲替尼治疗，考虑到观察到的快速、持久的反应和耐受性，在标准一线治疗之后，使用拉洛替尼或恩曲替尼可能是有价值的。在larotrectinib和entrectinib的临床试验中，反应通常是在第一次方案强制肿瘤评估时观察到的，而这些疗法中假性进展并不常见；因此，有可能快速评估治疗反应。然而，应该注意的是，没有关于拉洛替尼或恩曲替尼与标准的全身性细胞毒疗法进行比较或联合使用的数据。此外，TRK抑制剂的长期安全性尚不清楚，需要进一步研究。NTRK基因融合已被证明在肿瘤中持续存在一段时间，表明它们在不同的治疗过程中仍然是主要的致癌驱动因素。这为TRK融合癌患者采用TRK抑制剂序贯治疗方法提供了理论基础，类似于目前如EGFR、ALK非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗方法。下一代TRK抑制剂selitrectinib和repotrectinib由于能克服TRK激酶区域获得性耐药突变而从对larotrectinib或entrectinib耐药的患者中显示出令人鼓舞的活性，包括肉瘤患者。NTRK基因融合作为临床可操作的生物标志物的出现标志着肿瘤精准治疗的新纪元，larotrectinib和entrectinib的批准代表了药物开发的里程碑。TRK抑制剂提供了新的个性化治疗选择，有可能延长某些NTRK基因融合肉瘤患者的生存期并提高其生活质量。将NTRK融合检测整合到目前肉瘤患者的诊断工作中尤其具有挑战性，因为这种生物标记物非常罕见。
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