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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在
动物细胞系构建中的应用
一
CRISPR/Cas9的结构和编辑原理
早在上世纪八十年代，日本学者Nakata在大肠杆菌基因组中发现了一系列的短的间隔序列，但其功能一直为迷。随着基因测序技术的发展，人们发现这些重复序列广泛存在于细菌和古细菌基因组中，年将其正式命名为CRISPR。直到年，CRISPR/Cas9才被证明具有免疫能力，在E.coli中成熟的crRNAs引导形成Cas蛋白复合体，从而抑制病毒的增殖。年，由RNA介导的基因组编辑技术CRISPR/Cas9正式开始发展起来，并完成了在哺乳动物细胞中的基因组编辑。
基因编辑技术是通过基因的定点突变，以小片段的删除及目的基因的插入等方式对基因组进行精确修饰的一种技术，是研究基因功能的重要手段。目前，基因编辑技术主要经历了3个不同的研究阶段：锌指核酸酶（ZFNs）是第一代人工核酸内切酶，较传统的基因敲除技术易于操作、效率高、周期短，曾被应用于动物和细胞的定点修饰与基因敲除。但随着基因研究技术的发展，ZFNs技术在实际应用中存在制备繁琐、效能低、成本高的缺点，于是，TALEN技术应运而生。年，TALEN技术成功应用于目的基因的编辑，该技术应用简单高效、细胞毒性较小，被广泛应用于动植物细胞、人细胞及斑马鱼等模式生物的研究中，但该技术的靶点模块建立较复杂，耗时较长。直到年，Cong和Mali将CRISPR/Cas9系统成功应用于人类和小鼠基因组编辑，这样第三代人工核酸内切酶技术-CRISPR/Cas9技术迅速成为各国学者研究的重点基因编辑技术，并广泛应用于各种模式动物模型和细胞系的建立。
CRISPR/Cas9是存在于大多数细菌和古生菌中的一种获得性免疫系统。由多个重复序列和非重复的间隔序列组成，主要包括R-S结构和编码cas的基因操作子。R-S结构具有特异性识别外源DNA的功能，cas基因家族可编码多功能的CRISPR蛋白，并与成熟的crRNA共同作用构建能够抵御外来病毒入侵的免疫屏障。根据CRISPR/Cas9系统中cas蛋白的不同，将CRISPR/Cas9系统分为I、Ⅱ和III3种类型。I型和III型CRISPR/Cas9系统需要多个Cas蛋白的参与，Ⅱ型CRISPR/Cas9系统仅需要Cas9蛋白即可对DNA特定位点进行修饰，是目前研究的最彻底、也是应用最为广泛的。
CRISPR/Cas9系统的作用机制主要通过三个阶段实现：获得CRISPR可变间隔序列、转录crRNA前体与加工crDNA、crRNA-tracrRNA-Cas9复合体剪辑外源性DNA。与传统的ZFN、TALEN基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统通过设计不同的RNA向导对基因进行定点修饰，操作简单易行高效，基因修饰可遗传、无物种限制、实验周期较短、成本较低、对细胞毒性较小，适合于多基因、高通量的操作，可应用在各种不同的细胞和模式生物中，且发生同源重组的概率比自然发生同源重组的概率高。
二
CRISPR/Cas9技术在动物细胞系构建中的应用
随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究深入和不断完善，该技术已成为动植物基因功能研究和建立动物细胞系和疾病模型的主要手段，尤其在动物细胞系的建立方面起到了重要的作用。CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物细胞系中的应用主要包括基因的敲除和插入及基因修饰三个方面。
我国科学家针对猪的酪氨酸酶、PARK2和PINK1基因的外显子设计了Cas9打靶质粒，获得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2和PINK1双基因敲除的细胞系，该细胞系用于体细胞核移植后，成功培育出酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2和PINK1双基因敲除猪，建立了人类白化病和帕金森综合征两种猪模型，该研究团队首次将CRISPR/Cas9技术与体细胞克隆相结合，实现了大型家禽双基因的等位敲除，这对于人类遗传性疾病的研究有重大意义。近期，又有中国学者通过CRISPR/Cas9技术成功构建了酪氨酸酶(TYR)等位基因突变的猪胎儿成纤维细胞系和PARK2和PINK1双基因knock-out的细胞系，成功培养出基因突变的个体，并可稳定遗传给下一代。韩秋影等利用CRISPR/Cas9技术实现了细胞水平的基因敲除技术，同时构建了能稳定表达Cas9蛋白的HEK细胞，并运用CRISPR/Cas9基因转录激活技术，使得HEK细胞cGAS基因的转录激活。陈芳等通过sgRNA介导Cas9蛋白对目的基因的靶位点进行特异性切割，经同源重组或非同源末端连接方式进行修复，获得了Rev-erbβ基因敲除的HEK细胞系。
WHO统计结果显示，目前世界上有近多中疾病与基因发生异常相关，但在临床上仍缺乏有效的治疗体系，由于干细胞具有较强的可塑性和重建能力，因此干细胞基因修饰技术成为构建疾病模型、筛选靶向药物和制备治疗型干细胞的关键技术，也成为了人类基因疾病治疗的新希望。王晔博等利用CRISPR/Cas9系统编辑原理，在人的多功能干细胞WAN基因第6个内含子的高突变位点区域，设计了2个gRNAs，通过IDLV携带模板序列的方法筛选出了同源重组子，其正确率达50%，有效优化了人多功能干细胞中基因编辑效率，为研究发育生物学和某些疾病的机理提供了操作平台。吴福仁等利用Cas9核酸酶在sgRNA介导下可引起基因组DNA双链断裂，从而形成同源重组修复的特性，构建了绿色荧光标记的CD34报告基因AD细胞系，为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。韩笑等利用gRNA定位，引导Cas9蛋白精确定位进行DNA剪切，并启动DNA自我修复机制，建立了能稳定表达Cas9蛋白的小鼠胚胎干细胞系，实现了多个位点的同时编辑，同时运用Cas9核酸酶在DNA双链上精确剪切DNA，降低了Cas9剪切DNA的脱靶率，有效提高了应用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行基因编辑的效率。
因此，高效的基因编辑技术和精确的基因操作方法为构建所需的细胞系提供了必要的手段。目前，CRISPR/Cas9技术作为近几年兴起的第三代基因编辑技术，日渐广泛应用于病毒基因组的编辑、细胞系的建立及人类疾病模型的研究等各领域，提供了一种简单高效的基因重组的筛选方法，极大地推动了基因工程技术的应用研究。
三
存在问题
CRISPR/Cas9技术已开发为具有多功能的技术，但在长期的研究应用中发现，CRISPR/Cas9技术在动植物细胞基因改造及其他应用方面存在着脱靶的风险。CRISPR/Cas9系统是通过向导RNA（sgRNA）与目标DNA匹配，从而指导Cas9蛋白与特定基因位点结合并进行剪辑。设计的sgRNA可能与非靶位点的序列结合，导致基因突变，即脱靶效应。最近的研究显示，提高sgRNA的特异性，如通过减少或改变sgRNA与预测位点的碱基对，改造高特异性的Cas9蛋白等手段可降低Cas9基因编辑中的脱靶效应。
另外，CRISPR/Cas9技术是否对动物细胞产生毒性，改造病毒株生产的疫苗是否会引起免疫反应等问题都需要更深入的研究和探讨。因此，结合以上对CRISPR/Cas9系统结构和编辑原理、在动物细胞系建立中的应用及存在的问题等现状的分析，可进一步完善CRISPR/Cas9系统在干细胞中的同源修饰效率以及在造血干细胞中对遗传性P-globing异常疾病的基因治疗等方面的研究。
生产部葛玉凤编审李冬
2
猪传染性胃肠炎的诊断与防控
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种急性、密切接触性猪群消化道传染病。该病主要发生在冬春两季，尤其是冬春换季时期更高发，不同品系和年龄段的猪群都能被感染引起发病，10日龄内仔猪感染本病后病死率高达%，临床特征为腹泻、呕吐和脱水，是各个国家及地区危害养猪业非常严重的一种猪传染病，给各个养殖场造成了巨大的经济损失，同时给食品卫生行业造成了巨大的隐患。
一
TGEV病原学
TGEV属于冠状病毒科、冠状病毒属。基因组形式为不分节段的单股正链RNA，其大小为2.86×b，分为7个区，5’端有帽子结构，3’端有PolyA结构。最大的非编码区位于3’端N基因上游，不包括PolyA延长段，大小约为个核苷酸。第1个基因位于5’端，其大小约为2×b，由ORFla和ORF1b组成，编码病毒的复制酶和转录酶。其余6个基因，除基因3有2个ORFs(ORF3a,ORF3b)外，剩余都只有一个开放阅读框(ORF)。其中ORF2编码病毒的纤突蛋白（S蛋白），ORF4、ORF5编码病毒的膜蛋白（M蛋白），ORF6编码病毒的核衣壳蛋白（N蛋白），ORF3a、ORF3b、ORF7编码病毒的非结构蛋白。有文献报道，TGEV基因组容易发生很高的重组几率，跟分阶段的RNA病毒基因组相似。TGEV在冷冻条件下比较稳定，肠组织内的病毒在-20℃冻存条件下保存半年至一年半测病毒滴度无明显变化，但是此病毒耐热性差，在65℃10min或56℃45min条件下可全部被灭活。采集的粪便中的病毒放置在4℃条件下可存活存放8周左右、-20℃条件下可存活14d，37℃条件下放置24h后仍具有致病性。病毒暴露在光、紫外线下可立即被杀死，对三氯甲烷和去氧胆酸钠比较敏感，低浓度的消毒剂（推荐使用临洮威特公司高端消毒剂产品：威特格瑞）就可杀灭病毒。TGEV在较低的pH环境时（pH4-8）比较稳定，对胰酶有一定的抵御能力，能够耐受0.5%胰蛋白酶作用1h，但不同毒株对胰酶和蛋白分解酶的耐受性差别较大，TGEV的这种抵抗胰酶和蛋白酶的特性使得病毒能够自我抵抗胃肠的酸环境，使其不断繁殖，造成宿主出现较严重的临床症状。
二
TGEV临床症状
TGEV的潜伏期一般为7-21d左右，发病后常呈急性型，在第一个患病猪出现临床症状后经2-4天即可扩散至整个猪群，由于患猪性别、体重、饲养管理条件等不同，其临床症状也有一定的差异。
1、哺乳仔猪
14日龄内的新生仔猪感染TGEV后，常表现严重的腹泻症状并出现精神差、食欲低下、面色惨白、被毛粗乱、呕吐等症状，排出的稀粪呈黄色或黄绿色，混有未完全消化的豆腐样的食物，散发出浓烈的腥臭味，发病1周后常因为多脏器功能衰竭而死亡。14日龄内仔猪感染TGEV后的病死率可达到60%-%，14日龄后的仔猪病死率10%-45%，患病猪耐过后常表现出生长缓慢、饲料利用率低。目前，本病还没有任何切实有效的治疗方法，但采取对症治疗。
2、育肥猪
育肥猪感染TGEV后，常出现精神萎靡，食欲低下或不愿进食，体温下降，常排水样稀粪，稀粪呈现喷射状，患病猪因脱水而逐渐消瘦，大便呈反常的黄绿色、灰色和深褐色等，并伴有大量的的气泡和未完全消化的食糜，散发出腥臭味。患病猪通常情况下1周后就可完全康复，不再复发，育肥猪患病后病死率极低。
3、孕产母猪
喂奶母猪患病早期表现出食欲下降，不愿走动，随后出现腹泻或呕吐等症状；极个别病例高热至40-42℃，患病动物严重脱水，消瘦，发展至晚期出现极度虚弱；乳房萎缩，产奶量下降或者完全不分泌乳汁；初生仔猪因严重的缺奶、脱水，造成营养性贫血，绝大多数仔猪在短期内死亡；怀孕母猪感染本病后会出现流产、产木乃伊胎、死胎、弱胎。
三
TGEV病理解剖病变
TGEV主要病变在胃和小肠内。仔猪胃肠道水肿，胃充满未经消化的凝结物，胃黏膜充血，黏膜下层有出血斑点；小肠充斥着黄绿色或灰色液体物质，包含较小气泡和乳汁，小肠壁变薄，肠道扩张，肠系膜淋巴结肿大，肠系膜淋巴管可看到乳汁；肾脂肪变性和白色尿酸盐沉积，或出现肺炎。
四
诊断技术
1、病原学诊断技术利用透射电镜扫描是诊断TGEV的常用方法，通过将样品经磷钨酸负染后进行观察，可以清晰的看见病毒颗粒。其次，将病毒分离培养并提取基因组进行测序分析是最准确的方法。TGEV可以在PK-15细胞、Marc-细胞、ST细胞等细胞系上增殖并出现明显的细胞病变（CPE），将收集的疑似病料需盲传几代后才会出现CPE,不同的细胞系出现CPE的传代次数也不一样。
2、血清学诊断技术①间接免疫荧光技术（IFA）将收集的病毒接种于细胞或者将病料制作成切片后，进行IFA，此方法早已建立并被广泛使用。②血清中和试验（SN）通过将病毒接种到细胞上，将血清稀释成不同梯度，同时设置标准阴阳性血清对照进行检测，但SN特异性不高，有可能出现假阳性现象。③酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前诊断各种疫病最常用的诊断技术，主要包括间接ELISA技术、固相竞争ELISA技术、液相阻断ELISA技术等，可以检测抗原或者血清效价，该方法具有准确、快捷、特异性灵敏度高并且稳定等优势。
3、分子生物学诊断技术主要包括RT-PCR、qRT-PCR、LAMP以及RPA等以病毒cNDA为模板进行扩增的检测技术以及一些利用分子探针进行杂交的检测技术，如：膜杂交、原位杂交等技术。
五
防控
1、加强生物安全防护工作加强圈舍清洁工作，对携带大量病原体的排泄物及时清理，消毒，做好圈舍的通风、温湿度调节等工作，对圈舍周围环境、进出人员及车辆进行严格的消毒处理。加强管理，合理搭配营养，增强猪自身免疫力，坚持自繁自养、同进同出的养殖原则，若需从外面引种时，必须对引进猪进行检疫，以防带入病原体感染整个猪群，造成大的经济损失。
2、疫苗接种目前，疫苗接种是防控本病的主要手段。主要包括：①强毒疫苗：起初，人们利用病死仔猪的肠组织研磨稀释后饲喂怀孕母猪，通过母源抗体保护新生仔猪，但由于怀孕母猪持续向外排毒，使得该病反复出现，现已被禁止使用。②弱毒疫苗：弱毒疫苗经肌肉注射后刺激机体黏膜免疫，产生快速、高效的抗体，但同样存在着持续感染、毒力增强等风险。③灭活疫苗：可以很好地解决持续感染、毒力返祖等困扰，同时具有安全性强、易于规模化生产、保护率高等优势。目前，已经有商品化的PEDV+TGEV二联苗销售使用。④基因工程疫苗：由于分子生物学的飞猛发展，基因工程疫苗因其具有高安全性、低成本、制造简单等特点被广泛复方木尼孜白癜风用什么药膏好
