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动物形象：CRISPR
导读
CRISPR基因编辑技术，用任何赞美字词去称赞它都不为过。它为人类打开了新世界的大门，也开启了人类编制生命之网的历程。那么在过去的年，到底诞生了哪些优秀的成果呢？
年的一个闷热的下午，正在度假的西班牙微生物学家FranciscoMojica告诉他的妻子，他不打算回家了。多年来，Mojica一直在从事CRISPR研究，引导他进入这个研究领域的是一次偶然的发现：一个神秘的细菌DNA片段被插入了其他病毒的序列。
这个不归家的下午，后来成就了超过篇的文章，其中包括《Nature》、《Science》、《Cell》等顶级期刊的发表的文章。
Mojica博士和同事们偶然发现了一种古老的细菌性免疫防御系统，可以储存病毒的基因密码，如果将该系统比作警察，那它手里就有罪犯——病毒DNA的照片，那么任何之前侵略过该细菌的病毒会被立马清除出去。
这一发现可不可以被用于编辑其他基因呢？可以。
年，EmmanuelleCharpentier博士（柏林感染生物学Max普朗克协会的成员）和JenniferDoudna博士（伯克利大学霍华德休斯医学研究所的教授）的合作，证明了CRISPR系统（使用一种名为Cas9核酸酶）作为一种有效的基因编辑工具，能够定位和切割几乎任何DNA序列。
现在张锋博士和GeorgeChurch博士如果能够证明CRISPR/Cas9可以编辑人体内的基因，那么生物技术的革命暴风雨，将瞬间席卷全世界。
在过去的6个月中，我们看到了人类胚胎致病基因编辑的重大进展，包括基因编辑工具的拓展：RNA编辑器、CRISPR系统和超精密的基础编辑系统。
那么在年，有哪些巅峰的CRISPR编辑系统的进展，值得我们在这一年的年尾反复回味呢？
1.MaloryeAllisonBranca——CRISPR系统将改变临床的格局
年2月份，《Nature》子刊指出CRISPR编辑与测序技术相结合，可以大大提升遗传筛查的效率。
3月份，《Nature》发表斯隆凯特林癌症纪念中心的论文，利用CRISPR编辑构建强效CAR-T细胞研究论文，实现肿瘤的超强杀灭效果。
而如果说起基因编辑技术，就不得不提中国。年10月四川大学的LuYou教授第一个进行了CRISPR实验，他在肺癌患者的肺中注入能够降低PD-1活性的免疫细胞。虽然实验结果有效性被颇多人质疑，但是毫无疑问，这是一项创举。
CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1是目前广泛使用的基因编辑系统。目前来看，CRISPR临床前研究的结果振奋人心，例如血友病、杜氏营养不良症、眼部疾病或是甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的治疗。
随着CRISPR基因编辑的技术发展，其应用于临床的前景必将无比宽阔。
2.DeeAnnVisk博士——基因编辑系统的装备库
扩大CRISPR/Cas9的规模需要进行相关的结果验证。最简单的方法就是设计相关的基因库或检测试剂盒，使得CRISPR/Cas9越来越成熟。
Vermeulen博士对CRISPR/Cas9进行多组实验后发现，CRISPR编辑技术可以永久修改基因组DNA而不是暂时改变RNA的表达水平。DNA的合成能力近年来突飞猛进，研究人员能合成更长的DNA并且可以进行质粒的组装，从而简化CRISPR基因库的制备。
ATI可以用来评估CRISPR诱发突变的细胞系。通过使用高活性的T7核酸内切酶及相应仪器可以加快CRISPR的实验进程。长片段的PCR扩增技术已被高度选择性的T7DNA酶所取代。含有绿色荧光蛋白（GFP）标记的启动子可以解决二倍体细胞系中两个DNA突变鉴别的问题。这种标记可以用来评价细胞中被替换基因的启动子强度。
3.KateMarusina博士——怀疑论者的“毁灭帝”
在人类的感觉器官中，最容易受损的就是听力，而超过50%是遗传导致的。
为了对此进行研究，科研人员利用斑马鱼进行试验。听力受损的斑马鱼表现出一种特征性的循环游泳行为，以此来与野生型进行区分。研究人员利用基因编辑技术和转录激活因子核酸酶（TALENs），使得隐性纯合子的胚胎表达降低。而这个结果，大大减少了斑马鱼的遗传性听力损失。
4.MaryAnnLabant——基因编辑造福器官移植
利用CRISPR/Cas9技术，人类可以解决跨物种移植这个难题，解决人体组织器官的严重短缺。考虑到伦理和兼容性，器官移植一开始把重点放在猪的器官上。然而，年发生的猪内源性逆转录病毒事件使得全球禁止进行猪器官的移植，人类将所有的希望集中在转基因猪上。随后科学家在PK15猪肾上皮细胞上进行了相关实验根除了猪内源性逆转录病毒。
Milliporesigma公司推出了各种CRISPR产品，为广大科研人员服务。milliporesigma和威康信托基金桑格研究所经过两年的合作，开发出了第一个基因组文库筛选系统，从而减少了实验的时间。
5.MaryAnnLabant——基因编辑路在何方
CRISPR-Cas9基因编辑系统相较于经典的基因治疗所需时间更短，且基因组编辑组件可以被加载到病毒载体中，加速临床开发。早期的基因组编辑使用的是锌指核酸酶的方法（ZFN）。而CRISPR-Cas9的出现为基因编辑注入了新的活力。但CRISPR-Cas9有一定的局限性，例如靶向性和特异性。CRISPR目前只是用来辅助治疗CAR-T细胞以增强其疗效。
那么现在，CRISPR基因编辑技术可以用来做什么？
基因组CRISPR筛选识别调控蛋白
利用CRISPR进行遗传筛选可以控制相关遗传物质。研究人员构建了由同一启动子表达的绿色荧光蛋白（GFP），然后在其中一组的细胞启动子和GFP之间插入了目标基因调控元件，另一个组则没有。在几个不同的时间点通过对两组细胞进行流式细胞仪分离细胞，检测相应的荧光强度。通过这一实验，我们能够筛选人类蛋白编码基因，并确定负责调控相关蛋白的调节基因。
CRISPR/Cas9能够加快HIV的筛查
和治疗
多年来，高通量阵列基因组筛选技术一直是探究生物相关通路的标准，用来研究相应的生物学机制。CRISPR/Cas9的基因敲除技术具有高通量检测的优势，它能转化CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）与CRISPRRNACas9蛋白的合成和引物RNA。这项研究的重点是确定艾滋病毒感染的新靶点。通过表型、基因编辑率和基因敲除等方法验证了研究方法的准确性。作者在排除了几个宿主因子的影响后，证实了预期的表型，发现了新的基因靶点。因此，他们展示了利用CRISPR基因敲除筛选方法来确定HIV发病与新感染宿主之间的关系。
克服克隆筛选的瓶颈
CRISPR/CAS系统的瓶颈在于对含有致突变和杂合性的克隆体的测序。虽然可以用筛选方法加以解决，但成本和时间大大增加。目前，科学家们正在转向低成本的筛选方法。AATI已经开发出一个强大的T7核酸内切酶法，能够与片段分析仪无缝集成，用来对CRISPR基因编辑的精度进行测定。
高度特异的基因组编辑：
alt-rS.P.HIFICas9核酸酶3nls
