弓形虫（ToxoplasmaGondii）是细胞内寄生虫，弓形虫病是由弓形虫寄生而引起的一种传染病，猫科动物是弓形虫的最终宿主，虫卵随猫的粪便排出。
在感染弓形虫病后弓形虫可以隐藏在人的器官中，并在数年后重新出现。约有四分之一的世界人口长期感染非活性形式的弓形虫，在弓形虫活跃时会导致失明甚至死亡。
图1（图片来源：Cell）感染后某些弓形虫会转变成惰性形式，称为缓殖子（bradyzoites），弓形虫空泡被修饰成高度糖基化的囊肿壁，其中包含许多功能未知的阶段特异性蛋白，弓形虫的代谢在分化过程中也会发生巨大变化，依靠厌氧糖酵解而不是有氧呼吸并积累细胞质淀粉颗粒。它们在人体中无害定殖，许多人从未意识到自己是携带者。但是，缓殖子会重新激活并引起症状，对免疫系统较弱的人构成威胁，但目前对缓殖子分化的分子机制作者仍知之甚少。AP2DNA结合蛋白（ApiAP2s）被广泛认为是潜在的分化调节剂，但是单个ApiAP2基因的敲除可调节但不能完全消除缓殖子的分化。
图2BFD1介导弓形虫进入半休眠状态（图片来源：Cell）
剑桥麻省理工学院的SebastianLourido等1月16日在Cell杂志上发表论文”IdentificationofaMasterRegulatorofDifferentiationinToxoplasma”，报道了一种名为BFD1的基因，该基因对于弓形虫进入半休眠状态是必不可少的，可以帮助弓形虫躲避免疫系统并在体内终生存在，靶向BFD1可以帮助预防和治疗弓形虫感染。同日，Nature还为此做了专题报道。
图3（图片来源：Nature）
图4由于弓形虫的弓形虫感染而伤痕累累的视网膜。（图片来源：Nature）
研究亮点：
1.BFD1是弓形虫半休眠阶段分化的主要调节剂；2.ΔBFD1弓形虫不能在细胞培养基中分化或形成感染小鼠的囊肿；3.BFD1的条件表达足以诱导分化；4.BFD1结合半休眠阶段诱导基因的转录起始位点；
研究思路：
1.遗传筛选确定了弓形虫分化的假定调控因子；2.通过不同阶段的RNA测序来表征速殖子和缓殖子之间的转录组差异；3.替换完整编码序列BFD1，构建了ΔBFD1菌株并感染CD-1雌性小鼠；4.为了剖析分化过程并确定由ΔBFD1弓形虫表现出分化的缺陷程度，对弓形虫进行了单细胞RNA测序；
主要结果：
弓形虫在有效压力触发的条件下，急性期速殖子会分化成半休眠期缓殖子，形成对免疫清除和现有疗法有抵抗力的细胞内囊肿。作者在实验室弓形虫RH株中基于CRISPR的筛选，靶向约种潜在的核酸结合蛋白，包括在RNA-seq实验中鉴定为差异调控的基因以及具有转录因子中常见的DNA结合结构域的基因如锌指和Myb样结构域。基于cDNA测序确定义了BFD1开放阅读框的序列（2,aa），BFD1包含两个串联的SANT/Myb样DNA结合域，侧翼是缺少可识别基序的延伸。
图5BFD1是细胞培养中弓形虫分化所必需的核心因子（图片来源：Cell）
通过Cas9介导的筛选和单细胞分析，杂志确定了分化为细胞培养物和小鼠所必需的Myb样转录因子（BFD1）。BFD1在压力下积累，其合成表达足以驱动分化。与它作为转录因子的功能一致，BFD1结合了许多阶段特异性基因的启动子。
BFD1的缺失和随后的互补没有引起速殖子生长的缺陷。ΔBFD1弓形虫也无法自发分化或被诱导分化，BFD1的缺失导致动物感染过程中不能变成缓殖子，不形成特定组织囊肿因此不能在小鼠的大脑中形成弓形虫。全长BFD1的互补作用可将其分化恢复为野生型水平。不论诱导方法如何，BFD1的缺失都会阻止弓形虫分化。
图6BFD1是小鼠脑囊形成所必需的（图片来源：Cell）
在所有时间点对细胞生长条件和基因型进行聚类分析，发现速殖子和缓殖子簇之间有明确的划分，主成分分析表明细胞之间的大部分差异可归因于细胞周期或分化状态。在碱性胁迫下，野生型弓形虫迅速脱离速殖子细胞周期，并呈现向含有缓殖子发展的趋势。
图7需要BFD1才能表达缓殖子基因并启动分化（图片来源：Cell）
在碱性胁迫下72小时后，ΔBFD1弓形虫由于无法对这种胁迫做出适当反应而死亡。BFD1mRNA水平在不同阶段是恒定的，用组成型表达全长BFD1的构建体进行的瞬时转染足以在60％WT或ΔBFD1弓形虫中诱导分化，而缺少DNA结合结构域的突变体的表达则无法在任一基因型中诱导分化，说明需要BFD1才能使缓殖子分化，且BFD1足以驱动缓殖子分化，此外，BFD1优先绑定在差异调控基因的转录起始位点。
图8BFD1在没有压力的情况下足以驱动分化（图片来源：Cell）
在分化过程中BFD1会结合到许多上调基因的转录起始位点附近，其条件表达足以在不存在胁迫的情况下诱导分化，这为与胁迫诱导分化相关的许多转录变化提供了解释。
图9BFD1绑定到差异调控基因的转录起始位点（图片来源：Cell）
总结
通过Cas9介导的遗传筛选，作者确定单个基因（BFD1）是分化必不可少的。ΔBFD1弓形虫在标准条件下正常生长，但在所有测试的诱导条件下均无法分化，并且无法在小鼠中形成囊肿，这种缺陷可通过互补而逆转。ΔBFD1弓形虫无法进入休眠状态，无法在小鼠中形成脑囊肿，表明BFD1充当弓形虫中缓殖子形成的主要调节剂，ΔBFD1弓形虫可能是理想的减毒疫苗株。
BFD1的调节具有巨大的临床和生物技术潜力，因为半休眠感染是弓形虫治疗包括异源抗原治疗中的主要障碍。
撸猫虽过瘾，弓形虫也不得不防呀！
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