客户案例研究-CellMetric?CLD
本研究案例是几年前的一篇旧文，该公司当时采用的技术路线是基于minipools。新近介绍的Celonic公司之前也是用minipool的方法，现在他们则采用FACS做富集然后用VIPS做单细胞铺板和确证克隆性，最终节省了大量时间和用板量，感兴趣的客户可以一并参考一下（往期链接：用FASC做批量富集并结合VIPS和CM,一家CDMO企业节省了大量时间和用板量）。
CellMetric?CLD的用户SystImmune是一个在西雅图的单抗研发中心，其母公司是国内某知名制药集团，该中心在本研究案例发布之后也引进了VIPS系统。
使用CellMetric?降低30%的时间构建表达双特异性抗体的单克隆细胞株
简介
SystImmune公司拥有自己的抗体研发平台，他们的目标是快速构建高产量表达双特异性的抗癌抗体的单克隆细胞株，用于实体瘤的治疗。
SystImmune的细胞株开发
SystImmune使用CHOZN?(Sigma)作为表达平台。CHOZN?GS-/-CHO细胞系是一种内源性谷氨酰胺合成酶敲除细胞株，为必需氨基酸谷氨酰胺营养缺陷型，很容易据此来进行筛选。
在此平台上，SystImmune采用minipool方式来挑选高表达的克隆。这样做会在开始的时候花费较长的时间，最终还是期望得到高表达的细胞系。
除了CHOZN平台和minipool挑选法，SystImmune还采用CellMetric?CLD成像仪配合有限稀释应用于细胞株开发，这不仅帮助他们解决了单克隆源性的问题，还可以直接生成用于提交IND申请的文件证据。
应用以上方法，SystImmune能够从大量的转染minipools中成功筛选单克隆细胞系构建研究细胞库（RCB），产品产量至少为1g/L。
细胞株开发过程总览
SystImmune已经开发出一套成熟的细胞株开发流程，过程如图所示。（高清图，可放大阅览）
minipools转染和挑选：
CHOZN细胞被转染进感兴趣的基因，每孔铺-细胞。由于采用了CHOZN系统，回收率很高，例如接种2-5板，回收率可达约80%。到第14天时孔中会有大量多克隆细胞。由于扩增所有minipools是很困难的，因此会进行滴度测定来排除不表达的minipools。
minipools的扩增和筛选：
产物表达最高的50个minipools会选来扩增（通过静态培养和摇瓶），筛选并做滴度测定。静态扩增包括将minipool细胞从96孔转至24孔板，然后转至T25和T75瓶中培养。摇瓶扩增包括将minipool中的细胞扩增，后转至30mL分批补料培养摇瓶中。SystImmune要对30mL分批补料培养产物进行滴度测定，这样做的原因是有时静态扩增的滴度数据同最终生物反应器中滴度数据并不一致。
minipools细胞有限稀释：
至少挑选3个minipools，用40块96孔板进行有限稀释操作。首先实验用0.3-1个细胞/孔进行铺板，最后选择了最优的0.5个细胞/孔进行铺板。
克隆源性确证和存档：
CellMetric?CLD用于对40块细胞板进行拍照，分别追踪其在Day0,Day1和Day2的细胞分裂情况，并在Day7拍照显示其克隆形成情况。在此阶段，SystImmune确认了约-个克隆有着高抗体滴度值，从中选择至少50个CellMetric确认的滴度最高的进行扩增。这种单细胞克隆的确认需要非常严格，将生成相关报告用于提交IND。
克隆扩增：
先前步骤中选出的高表达克隆（基于图像和滴度数据）用先前同样的方法，从静态培养到摇瓶培养进行扩增。另用一个30mL摇瓶补料分批培养，将高表达克隆继续扩增。
克隆评价：
SystImmune基于细胞生长和滴度测试来最终确定哪些克隆被送到生产部门，还需要将细胞培养上清进行纯化，然后交到分析部门进行蛋白质量检测——CE-SDS（毛细管电泳-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳），HPLC-SEC（高效液相-尺寸排阻色谱），CIEF（等电毛细聚焦），结合功能测试，此外还要检测拷贝数和支原体。
生产部门：
最终SystImmune挑选了8个产量最高的克隆送去生产部门，进行3L生物反应器发酵，进行活细胞密度（VCD）和IgG产量分析。
产生候选克隆：
最后，挑选出最佳的候选克隆创建研究细胞库（RCB）。
细胞系开发过程中面临的挑战
同其他公司的CLD部门一样，SystImmune公司在日常工作中也面临着一些关键的问题：
细胞株开发过程中多步骤的复杂性
部门人手不够
降低时间周期及成本
每个步骤中建立标准流程
提交IND申请时可以形成规范的文件
可以证实细胞的克隆源性
对于后面两点，同其他公司一样，SystImmune公司已经敏锐地觉察到FDA对于细胞系单克隆源性的要求，FDA的SarahKennett博士曾做过“EstablishingClonalCellLines-ARegulatoryPerspective’presentation”的报告。里面概述了ICHQ5D的条款：“Forre
