植物研究中常用的突变体材料主要包括T-DNA插入突变体，EMS诱变突变体和辐射诱变突变体材料。在进行基因克隆研究时，T-DNA材料可以利用Tail-PCR策略，EMS诱变材料则主要是利用MutMap测策略，一般均能快速对相关基因进行克隆。不用于以上的两种材料，辐射诱变往往引起染色体水平的变异，包括染色体易位，倒位，大片段的插入或者缺失，一般的策略很难快速对辐射诱变基因克隆。近期有文章发表了一种基于PCR的策略对辐射诱变突变体材料进行目标基因克隆，相关研究发表在年10月份的《NaturePlants》上[1]。本期图谱君对该篇文章做解读。
本文用到的材料如下：
快中子辐射后的苜蓿（A17）突变体和野生型亲本+T-DNA插入拟南芥突变体；
性状：突变体负向地性；
方法：PCR-basedgenecloning；
具体研究内容：
利用基因芯片检测野生型和突变体中根系的基因表达差异（类似于RNA-seq），发现有5个相邻的探针处突变体的基因表达量显著降低（图1a），然后基于探针的序列信息设计引物进行PCR反应后测序，发现这5个探针（蓝色框）处在突变体中均无条带，而在野生型个体中均有条带，也即基于PCR的染色体步移策略发现突变体中存在一个49Kb的缺失（图1c），通过基因组注释发现该区域包含了4个基因；
图1PCR-based基因克隆
下一步通过挖掘以往的表达数据，发现5个探针中仅有第4个探针在根中特异性表达，因而确定该探针处的基因为pre-candidategene。另外，通过筛选拟南芥的T-DNA插入突变体库发现该基因附近插入的突变体表现出同样的根负向地性表型。到这一步即可确定该基因为唯一的一个candidategene。
确定候选基因后通过生物信息分析发现该基因编码个氨基酸，功能却未知。在不同的物种中均发现该基因的直系同源基因存在，这些直系同源基因具有类似的外显子内含子结构，编码的氨基酸相当保守。在拟南芥和水稻中各有3个直系同源基因，且水稻中的一个基因已经被克隆[2]，且控制根系的结构建成，如图2所示：
图2基因功能注释
由于该基因在不同的物种中十分保守，且水稻和拟南芥中各有3个同源基因，为了研究该基因是共同发挥作用还是基因的冗余效应，作者在拟南芥中构建了这3个基因的单基因突变，双基因突变和3基因突变体，发现只有3基因同时突变时才会出现根系负向地性的表型，验证了冗余效应的推测，同时也从侧面验证了该基因的保守性（图3）。
图3拟南芥突变体表型
除了以上内容，作者还研究了不同基因的启动子对其他基因的启动效应，最后发现同一个启动子可以启动不同基因表达并且发挥功能。
总结本篇文章利用非常简单的方法（芯片测定表达量+PCR测序）就克隆了根系负向地性基因，性价比非常高，但是具有一定的运气成分。因为如果这个缺失片段比较大的话通过PCR手段很难将突变的全长扩增出来，另外，作者也充分利用已经发表的数据和已经构建的突变体库，重新整理为我所用，后期可能还需要继续对该基因如何行使功能进行进一步的分子生物学研究。
参
考
文
献
[1]GeL,ChenR.Negativegravitropisminplantroots.NaturePlants,,2:.
[2]UgaY,SugimotoK,OgawaS,etal.ControlofrootsystemarchitecturebyDEEPERROOTING1increasesriceyieldunderdroughtconditions.NatureGenetics,,45(9):-.
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