摘要
成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统。与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9操作更加简便、高效。目前，该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用，包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面。CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题，但其应用前景非常广阔。本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述。
肿瘤具有多基因型的特征，且基因变异驱使肿瘤的恶性发展和化疗耐药，纠正或删除这些变异基因是未来肿瘤治疗发展的一个方向。成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatednuclease9,CRISPR/Cas9)是近几年发现的基因编辑技术，由于其高效性和精确性已被广泛应用于肿瘤治疗研究，利用这一技术鉴别并删除肿瘤耐药基因可有效地防止肿瘤细胞对药物的耐受[1]。它来自于细菌和古细菌中的免疫防御系统。为防御病毒或噬菌体的入侵，细菌针对特异性DNA序列并将其作为记忆，在后来的入侵中特异性序列被酶识别和降解，重新设计这个天然的免疫防御系统能达到理想的基因编辑效果[2]。目前CRISPR/Cas9系统已在哺乳动物细胞中得到成功的应用，大大加速了基因工程的发展。通过稳定或不稳定地导入CRISPR成分，Cas9能成功介导单个或多个内源性位点的稳定修饰[3]。有研究团队已报道，通过不稳转染质粒编码的Cas9和单向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)或Cas9-sgRNA核糖蛋白复合物(RNP)成功编辑了内源基因；利用Cas9核酸酶和deadCas9(dCas9)效应器进行高通量CRISPR筛选以鉴别、分类与不同生物表型有关的基因；利用CRISPR/Cas9技术精确敲除小鼠体内基因，能快速产生小鼠遗传模型[4]。此外，CRISPR/Cas9比传统的蛋白引导的编辑工具锌指核酸酶(zincfingernucleases,ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(transcription-activator-likeeffectornucleases,TALEN)更有优势：①ZFN或TALEN工具需要重新合成大量的引导蛋白，而CRISPR/Cas9靶向新的位点仅需要一个互补sgRNA，相对更加简单；②CRISPR/Cas9系统中，多个sgRNA可靶向不同的基因位点，使Cas9能同时平行编辑不同的基因[5-6]。这些优点使CRISPR/Cas9技术深受研究者的青睐，并被广泛应用。
CRISPR/CAS9具有高效的基因靶向作用，通过设计特异性sgRNA定点靶向耐药基因或致癌基因并将其删除或修饰，可快速、有效地逆转肿瘤耐药，这一技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用。
1 CRISPR/Cas9基因编辑技术
1 CRISPR/Cas9系统结构
CRISPR/Cas9系统组成简单(图1)，其基因座从5′端到3′端为反式激活CRISPRRNA(trans-activatingCRISPRRNA,tracrRNA)，一系列CRISPR相关基因即Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1和Cas2，后者是获得新间隔序列必需的基因，靠近3′端是CRISPR基因座，此基因座由长度相似的间隔序列(spacers)与一系列高度保守的正向重复序列(repeats)间隔排列组成；另外在CRISPR位点，第1重复序列上游有一段前导序列，可作为启动子启动CRISPR基因序列的转录。
图1 CRISPR/Cas9系统结构示意图
1.2 CRISPR/Cas9系统作用机制
CRISPR/Cas9系统通过序列特异性地靶向外源DNA或RNA防御外来基因的入侵，特别是病毒和质粒。一个CRISPR/Cas9基因位点包括1个CRISPR相关基因序列即Cas9基因和1个CRISPR序列基因，后者为一系列被间隔序列间隔开的重复序列，间隔序列是适应免疫的关键因素，因为它们储存第一次不成功的外源基因入侵的“记忆”，这个“记忆”能识别并使第二次的入侵瓦解[7]。
CRISPR/Cas9介导的免疫过程包括3个步骤：适应、表达和干扰（图2）。
图2 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑原理示意图
①适应阶段：Cas9蛋白复合物靶向入侵的外源DNA片段原间隔序列(protospacer)并将其裂解，原间隔序列经加工后，作为新的间隔序列整合入宿主CRISPR序列的5′端；②表达阶段：CRISPR序列发生转录，整合入CRISPR序列的原间隔序列被转录成前体CRISPRRNA(pre-crRNA)，随后被加工成成熟的CRISPRRNA(crRNA)，crRNA与tracrRNA形成双链二级结构-R环，Cas9蛋白聚集在其周围，三者组合成CRISPR核糖核蛋白复合体；③干扰阶段：当同源病毒或质粒入侵时，在Cas9核酸酶的作用下，CRISPR核糖核蛋白复合体识别原间隔序列毗邻基序(protospaceradjacentmotif,PAM)并对与crRNA互补的外源双链DNA(dsDNA)进行剪切。
1.3 基因切割位点的选择
通过共表达特异性sgRNA和核酸内切酶Cas9，CRISPR/Cas9能靶向剪切任何＜20个核苷酸的DNA序列，要实现精确的剪切，需要满足2个条件：①靶点序列与基因组中的其他序列相比是独特的；②靶点需位于PAM的上游，结合靶点需要PAM序列，精确靶向序列依赖于Cas9的特异性。Cas9蛋白通过其表面的活性结构与sgRNA(crRNA与tracrRNA复合物)的支架结构域结合成核糖蛋白复合物，与sgRNA结合后Cas9的构象改变，将无活性的、非DNA结合构象分子转变成有活性的DNA结合构象分子，Cas9-sgRNA复合物的切割位点将与PAM上游基因序列结合，但只有与间隔序列配对的基因才能被Cas9切割。Cas9核酸酶有两个功能内切酶结构域：类RuvC结构域和HNH核酸酶结构域。HNH可对与间隔序列互补的DNA单链进行切割，其切割位点在PAM上游3个核苷酸(nt)处，而类RuvC结构域对另一条链进行切割，其切割位点在PAM上游3～8nt处，结合靶点后，Cas9进行第2次构象改变，将核酸酶定位到切割位点对DNA链进行切割。Cas9介导的DNA切割的结果是双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，靶点DNA在PAM序列上游3～4nt处。
2 CRISPR/Cas9技术在耐药研究中的应用
CRISPR/Cas9技术操作简单且能精确地剪切基因，因此已广泛应用于基因工程，它在肿瘤生物学中的应用主要在以下几个方面：①快速建立遗传模型，CRISPR/Cas9系统能对内源位点快速靶向修饰，为建立遗传模型提供了更加简便的方法，除了简化原癌基因和肿瘤抑制基因的研究，还能快速鉴别驱动和携带突变(driveandpassengermutation)；②快速建立小鼠模型，CRISPR介导的基因编辑系统能够快速产生大量具有基因组成或结构变异，或染色体重排的脴胎干细胞系，这些细胞系能用于建立具有多种变异表型的肿瘤遗传工程小鼠模型(geneticallyengineeredmousemodels,GEMM)和非种系遗传工程小鼠模型(non-germlineGEMM,nGEMM)；③体细胞基因组工程，CRISPR/Cas9系统能在体内和体外对体细胞基因组进行编辑[8-10]。此外，目前其在研究肿瘤耐药方面也得到了广泛的应用。
2.1 在乳腺癌耐药研究中的应用
根据不同的乳腺癌亚型，患者可使用化疗或靶向治疗方法，但原发性耐药或获得性耐药是不可避免的。肿瘤细胞对药物产生耐药，发生上皮-间充质转移(epithelial-mesenchymaltransitions,EMT)，迁移到远隔器官，导致患者死亡[11]。乳腺癌靶向药物曲妥珠单抗的治疗靶点是HER2基因，在乳腺癌患者中HER2基因过表达占15%～20%。Wang等[12]利用CRISPR/Cas9技术靶向HER2过表达乳腺癌细胞中的HER2基因，有效抑制了细胞增殖和致瘤性，而且还证明了在ADP多聚酶聚(ADP-核糖)聚合酶〔poly(ADP-ribose)polymerase,PARP〕抑制剂处理后，CRISPR/Cas9的靶向效果更加明显，这一研究为抗乳腺癌治疗提供了一个新的机制。
SHCSH2结合蛋白1(SHCSH2-bindingprotein1,SHCBP1)是SRC的同系物，是胶原蛋白SHC家族的成员之一，最近报道称SHCBP1基因在乳腺癌细胞中也存在过表达现象。Wen等[13]证明了SHCBP1过表达使乳腺癌细胞增殖能力上调，增强了乳腺癌细胞的耐药性，他们利用CRISPR/Cas9技术敲除SHCBP1后观察到细胞增殖明显受到抑制，说明SHCBP1在肿瘤发展中起着重要的作用，能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。
BRM和BRG1ATP酶是高度保守的同系物，催化染色质对多亚基人SWI/SNF染色质重塑酶的功能进行重塑。Wu等[14]证明了BRM和BRG1在乳腺癌耐药细胞中过表达，他们利用CRISPR/Cas9技术敲除MDA-MB-和MDA-MB-细胞中的BRM和BRG1。结果表明，这两个基因中敲除任何一个都能减少体内肿瘤的形成，并在体外抑制肿瘤的生长。这一结果暗示BRM和BRG1可能成为肿瘤治疗的新靶点，促进逆转耐药的研究进展。
抑制雌激素受体(estrogenreceptor,ER)α活性的药物能有效抑制乳腺癌发展，然而，耐药性的产生是现在临床治疗的主要问题。最近研究显示，在治疗过程中，ER基因的变异率＞20%，而且这些变异大多数只是几个氨基酸的突变。Harrod等[15]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使MCF7细胞中单个氨基酸残基-酪氨酸突变，产生酪氨酸变异的细胞系YS，利用RNA序列分析技术和ER芯片序列分析基因组变化。结果显示，YS突变增强了ER基因活性，促进细胞生长，变异的MCF7细胞对抗雌激素的药物他莫昔芬和氟维司群产生耐药。这些研究说明了ER突变在内分泌化疗耐药中的重要性，并证明了利用敲除变异模型研究新的治疗方法的重要性。
2.2 在白血病耐药研究中的应用
白血病是一种常见的血液恶性肿瘤，主要以联合治疗为主，但多药耐药(mutidrugresistance,MDR)依然是化疗失败的主要原因[16]。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,TKI)能用于治疗慢性粒细胞性白血病(chronicmyelocyticleukemia,CML)，但是白血病起始细胞(leukemiainitialcell,LIC)对TKI耐药。Xie等[17]证明了多梳抑制复合物2(poly北京治疗白癜风的医院哪家最好北京中科医院是假的吗
