在DNA的转录过程中,遗传信息从DNA传递到RNA,除了RNA聚合酶外,转录因子(transcriptionfactor,TF,以下均称TF)也是不可或缺的。当我们推断某个TF作用于某基因的启动子区域,如何通过实验来验证呢?下面一起来了解几个常用的方法
1,ChIP(ChromatinImmunoprecipitation,染色质免疫沉淀)
2,CUTTAG
3,荧光素酶报告基因
4,EMSA
1,ChIP(ChromatinImmunoprecipitation,染色质免疫沉淀)
基本原理是将细胞用甲醛固定后,使用超声波或酶将染色质打断成bp以内的片段,把偶联在琼脂糖珠法或磁珠上的proteinA/G,抗体,裂解液共同孵育,抗体通过结合TF间接与TF作用的染色质结合,而proteinA/G与抗体结合,进而形成beads-抗体-TF-染色质片段复合物,最后纯化出该复合物中DNA,通过PCR或测序检测。
最早推出ChIP试剂盒的是upstate公司(信号通路抗体公司cellsignaling公司最强劲的对手,但并入millipore之后名气和实力大减,使得cellsignaling在信号通路抗体上一枝独秀)或Activemotif,文献最多的是upstate。ChIP抗体最强的也是他们。这几年中,abcam,cellsignaling凭借强大的品牌实力,在ChIP抗体方面占领了很多的市场。ChIP试剂盒方面,cellsignaling做的也是有声有色,和millipore有分庭抗礼之势。
ChIP试剂盒主要有以下几种:
各类
优点
缺点
琼脂糖珠
不需要磁力架
操作麻烦,需要非常小心;背景可能相对较高
磁珠
操作方便,便捷;背景低
需要磁力架
超声法
随机打断;得到的片段更均一;作用力强,打断更彻底
需要超声波破碎仪,超声过程麻烦,超声条件需要摸索;
酶法
操作简单;条件温和
酶有特异性的切割位点,有些蛋白可能不合适;得到的片段过长或过短;温和的酶处理可能不如超声法打断彻底
下面这个链接详细介绍了超声法和酶法的区别,供大家参考