在基因治疗药物的生产放大工艺过程中最关键的就是上游病毒载体的生产，除了一些可以悬浮生长的肿瘤细胞或血细胞系，大多数用于产生病毒载体的细胞系都是自然贴壁细胞。
在过去的5年中，越来越多的人逐渐转向通过悬浮细胞进行生产，而且这一趋势在过去的一年里似乎有所加速。目前，大约70%的开发产品都使用贴壁细胞，包括FDA批准两种的基因疗法。转向采用悬浮细胞，需要开展持续性的开发工作，尽管目前没有获批使用杆状病毒载体的产品，但它们的发展也有了显著的增长。以下我们简单罗列了市场上考虑贴壁和悬浮工艺选择的比较（下表），并分别对两种工艺进行了阐述。
表1，贴壁和悬浮工艺的比较
贴壁细胞放大工艺用于载体生产
对一些小规模需求或较小的临床样本，载体生产使用了基于贴壁工艺的“扁平器皿”装置生产系统。这主要涉及到多层细胞工厂(CF)或HYPERFlasks?/Stacks(HY)(Corning)。经证明，HYPERFlasks和HYPERStacks的气体交换膜可提高LV产量。因此，培养基/表面积体积方面的灵活性优于细胞工厂，每个单位的面积高达1.8m。但是，要显著提高生产规模，还需要增设更多的装置。CorningCellCube?系统可以纵向扩展至34m。然而，CellCube系统只能部分实现一次性使用。使用生物反应器有助于增加生产规模，因为生产规模的增加不需要繁琐地准备少量较大的容器。其他优点包括易于监测和控制工艺、减少记录保存、减少装置操作、降低污染风险，减少设施空间和降低操作成本。生物反应器中培养条件的控制优化，也可能促进生产率的提高。此外，许多生物反应器系统也适用于灌流，令其在逆转录病毒和慢病毒等一些载体系统中颇具吸引力。Quantum?(TerumoBCT)等中空纤维生物反应器利用中空纤维提供细胞贴壁表面，以较小的占地空间实现扩大的生产规模。固定床生物反应器技术已被业界普遍认可。例如，在已上市药物Zolgensma?的生产中使用了iCELLis?固定床生物反应器（图1）（Pall）。图1适用于工业规模制造的iCELLis+在最大规模下，iCELLis提供的面积大体相当于个转瓶、个10层堆叠或80个HYPERStacks（表）。其固定床的高度和载体的压实密度均可组合选择从而有不同平米数的规格选择，同样该技术也提供了适用于工艺开发及优化阶段的小试研究设备iCELLisNano。表.iCELLisNano和+生物反应器的可扩展性选项在一项预计横向扩展L至0L方案下成本削减的建模研究中，证明了iCELLis生物反应器相对于多层堆叠培养系统的成本效益。这项研究通过基于转染的方法模拟了一个典型的LV生产活动。结果预计，iCELLis将使商品成本降低50%，优化（使用灌注和质粒）后商品成本降低1.6到1.9倍，灌注使通量提升3倍。工艺复杂度也大幅降低。因此，与传统的扁平器皿相比，iCELLis生物反应器带来了诸多好处，包括成本的显著降低和工艺的简化。悬浮细胞工艺用于载体的放大生产
虽然中空纤维和固定床生物反应器系统的规模显著提升，但与可以扩展到数千升的搅拌釜式生物反应器相比，目前的规模仍然有限。病毒载体领域的研究者正在探索使用悬浮细胞系进行基于瞬时转染的病毒载体生产。将贴壁培养的细胞系调整为悬浮培养方法会增加工艺开发时间，但是，一旦筛选出最佳细胞株，将不再需要用于细胞贴壁培养的基质。在单抗和重组蛋白的商业化生产中，搅拌釜式生物反应器是目前为止最常用的生物反应器。因此，该技术已经过透彻的研究，行业和监管机构对其操作都非常熟悉。它们是扩展到大规模生产的最有效手段。虽然这些生物反应器可借助微载体来培养贴壁细胞，但它们最适合悬浮细胞的生长。HEK93哺乳动物细胞和SF9昆虫细胞都能适应悬浮培养。搅拌釜式生物反应器有各种大小和配置可选，品牌也众多，目前最大体积可至7升(升工作体积）（ABEC)，由于今年的新冠疫情也进一步推动了载体苗的发展，今年AstraZeneca的新冠疫苗采用了AllegroSTR搅拌釜式生物反应器(Pall)生产其腺病毒载体，AllegroSTR生物反应器是一种一次性生物反应器，有50、00、、0和L的规模可供选择（图）。图.AllegroSTR搅拌式生物反应器系列50L-L选择上游工艺的关键考虑因素
1.悬浮细胞培养目前的挑战和局限性使定制的细胞系适应高增长需要一段时间，可能达一年之久甚至更长时间，这将会延迟疗法的上市时间。此外，还不能保证适应工作能否使悬浮细胞系具有与原始贴壁细胞相同或达到更高的细胞特定生产率。
00L以上规模的细胞转染目前还面临着诸多挑战，这将会限制悬浮培养在转染依赖性过程的应用。
大规模优化转染效率通常也需要大量的开发时间。
目前在载体生产中使用的许多细胞系不一定能实现单细胞密度的高增长。例如，目前培养基配方中的HEK93细胞在密度超过00万细胞/毫升时容易凝结。这要求载体开发者务必尽可能了解悬浮培养对其特定载体、细胞和市场的优缺点。
虽然悬浮细胞系的使用目前在市场上所占份额较小，但在过去几年中悬浮细胞系的采用率显著增加。.成本考量目前，有几个因素可影响基于病毒的基因治疗生产成本。包括生产滴度、生产工艺纵向扩展的能力、监管负担和其他因素。生产滴度是一个关键因素，因为滴度越高，生产工艺的规模越小，成本越低。高滴度的载体生产除了可以实现更高效的下游操作，还可以降低对试剂、劳动力和设施的要求。控制细胞环境和生产条件是提高滴度的一种可能途径。在这方面，受控的生物反应器容器在生产率上比转瓶、CF或其他扁平器皿更具优势。
使用生物反应器可以简化工艺的纵向扩展。
从资本支出的角度，多层堆叠的纵向扩展需要占据相当多的空间。由于洁净室的空间很昂贵，这将构成一项非常重要的开支。相比之下，生物反应器系统的实现可以在中等尺寸的多层堆叠系统所需的相同空间内完成。
生物反应器系统的应用可以将劳动力和耗材成本降低3倍，并且生物反应器系统产生的塑料废物大大减少，还降低了处置成本，灭菌和广泛的验证。
在多层CF中使用贴壁细胞的工艺横向扩展需要许多连接和培养箱，因此污染风险和资本支出成本都将增加。
载体灭菌的局限性也可能会影响成本，因为HSV等大病毒可能无法经由过滤器灭菌，因此需要无菌处理以及相应的验证。由于一些基因治疗产品对监管机构来说是新生事物，随着更多的产品涌入市场，监管机构极有可能增加监管指导，进而导致未来成本增加。
3.决定成本的工艺设计和监管负担生产设计对成本有很大的影响。虽然通过转染生产载体容易、灵活、上市时间快，但随着规模的增加，成本和技术挑战都将增加。GMP质粒的成本是上游操作的最大成本动因之一。使用辅助病毒（供直接感染）代替质粒可以降低转染需求，并减少生产规模的纵向扩展所需的费用。在这方面，使用稳定的生产细胞系来减少或消除转染和转导大有助益，可以减少生产步骤，降低成本。与转染方法相比，使用稳定的生产细胞系还可以促进工艺的一致性，而这是GMP载体生产的一个属性。生产拟用于治疗的载体所需的所有成分都需要以符合GMP要求的途径生产，因此优化或消除昂贵的GMP步骤也是一个重要的考量。满足监管规范是一项关键要求。根据纯度和安全性的监管负担，对整体工艺设计进行优化可以大幅降低生产成本。包括潜在毒性或免疫原性杂质、污染物（如HCP蛋白质和DNA）、质粒DNA、转染试剂、潜在转导抑制剂、诱导剂和抗生素等。其他优化包括优化转染以减少昂贵的质粒消耗，优化细胞培养基的进给以提高生产率，以及优化大型生物反应器的细胞收集，使细胞汇集后以单一路径进入下游处理环节。虽然在优化整体工艺需要开展大量的工作，但也能产生重大的长期效益。总体上，非优化生产工艺，例如研发阶段使用的生产工艺，据估计可增加40%的成本，减少33%的制剂通量。4.工艺开发时间考量要求的上市速度和总体成本是工艺开发的两个考虑因素。基于贴壁的生物反应器系统的工艺开发时间优于悬浮细胞系统。所需的细胞开发和优化相对较少，可以相对加快进展，而且细胞工厂对贴壁细胞过程的适应可能相对较短。相比之下，使贴壁细胞系统适应悬浮细胞系统的过程可能非常漫长（8-18个月），这可能会推迟产品上市的时间。对于产率要求高、成本低、许可上市时间长的产品，开发悬浮细胞或稳定的生产细胞系，尽管其产品的开发可能需要数月甚至数年的时间，但可以长期受益。事实上，一些载体生产商选择凭借转染/贴壁细胞工艺进入市场，并且同时开发稳定的生产细胞或悬浮细胞（或两者皆开发），留待将来使用。开发一个符合严格监管标准的工艺可能需要相当长的时间。上游工艺包含很多部分，例如培养基优化、细胞系优化、细胞库的创建和（稳定）细胞系的使用。这些部分需要考量多个因素，而且需要相当长的时间才能成功推向市场。5.分析考量拟用于基因治疗和疫苗应用的最终载体产品必须经过透彻的研究，并且数量、纯度和效力都应满足生产商和监管机构的要求。这要求制定适当的表征方法，建立并理解成熟且可复制的病毒生产工艺。控制和产品表征不仅对最终产品很重要，在生产过程的不同步骤中也起到至关重要的作用。上游生产对下游工艺的影响巨大，因此必须深入了解上下游加工过程。有时，即使是上游工艺中的微小变化也会导致下游工艺的效率降低。载体生产的分析技术取得了持续的进展。传统生物制剂（即重组蛋白、酶替代疗法、单克隆抗体）的成熟框架正在越来越多地被基因治疗领域所采用。因此，为了表征工艺和产品中间体，载体生产需要加大对实时、高通量技术的投资。6.上游对下游纯化的影响许多载体会分泌到培养基中。在这种情况下，可以从培养基中收集病毒，从而大幅减少下游负担。对于某些载体，一部分病毒会残留在细胞中，因此，用清洁剂或物理方法裂解细胞是提高产率的关键。有各种各样的纯化工艺可以使用，包括通过过滤或离心进行澄清；亲和、离子交换、上浆、多模和其他树脂的色谱步骤；TFF或超速离心浓缩步骤；还原核酸的酶处理。当必须裂解细胞以释放载体产品时，可能需要多个步骤来优化纯化效果。上游生产工艺的选择会影响下游的纯化负荷。例如，对微载体系统或其他流体运动系统上的贴壁细胞施加的剪切力会增加细胞碎片。下游生产工程师最关心的是上游操作的生产率、质量和材料的一致性。7.改进空间在载体设计和上游工艺如何影响最终载体产品的感染性和质量以及如何减轻纯化负担方面，业界对这一领域的兴趣有所上升，投入的工作力度也在增加。影响载体制剂质量的两个方面包括：（1）完整粒子到空粒子的水平（）感染衣壳到非感染粒子的水平。这些因素从本质上决定产品的效力和潜在的副作用水平，例如效力丧失或免疫(CTL)反应。理论上，理想载体制剂的总粒子数(vp)与感染粒子数(iu)之比为1。业界已然注意到，野生型AAV高纯度制剂几乎可以达到这一比率。但是，同样纯化的rAAV载体制剂的感染性小于1/的粒子。因此，在载体设计、细胞系或生产重组载体的方法上仍有改进的空间。研究表明有几个因素可影响这些质量参数，例如培养方法（摇瓶、摇瓶分批补料与生物反应器）、通过转染或转导生产等。此外还注意到的一点是，AAV粒子在细胞裂解液和培养基中的相对分布依赖于特定的载体。因此，要生产特定生产率高的载体，还有很多有待了解的知识和改进的空间。为了制备某些临床应用所需的剂量，在更大规模下进行转染存在问题，且造价昂贵。需要进一步改进稳定生产细胞系的使用。如果使用大型釜式生物反应器开发适应于悬浮的稳定生产细胞系，可以进一步提高产量。继而，这些生产细胞系可以在污染风险更小的封闭系统中使用，无血清、无动物培养基的使用将减轻纯化负担，改善监管安全性。目前的细胞裂解方法（例如AAV）也很粗糙，尚有改进的空间。烷基酚乙氧基化物(APE)表面活性剂（例如壬基酚聚氧乙烯醚(NPE)和辛基酚类聚氧乙烯醚(OPE)）在欧盟国家的使用受到限制，并且将于01年1月受到严格限制。这一限制包括其中一个使用最广泛的溶解剂—TritonX-。虽然需要持续改进治疗载体的生产，但基于病毒的基因治疗的前景仍十分乐观。在未来，基于载体的基因治疗不仅可以提供基因替换，还可以提供基因编辑功能。结束语
显然，基因疗法的前景在飞速变化，并且技术的发展势必会推动其进入这一革命性的医学领域。目前基于载体的基因疗法比较昂贵，每剂高达1-百万美元。市场对单个病毒和生产工艺普遍较为了解。然而，目前关于两者在病毒产品生产中的相互作用方面还欠缺经验。随着新兴载体生产行业中新技术的进步，未来的生产成本预计将有所下降。这是一个新兴的行业，在向前发展的过程中有许多亟待学习的方面。END
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