CRISPR-Cas9基因编辑技术已经彻底改变了生物医学研究领域。Cas9切割基因组DNA后，DNA损伤反应(DDR)蛋白被招募来启动复杂的修复过程。尽管我们已经了解到DDR受靶序列，细胞周期和染色质动力学等因素的影响，但细胞事件的确切时间和序列仍需进一步研究。Cas9很有潜力作为研究DDR动态的工具，但目前缺乏必要的控制水平来根据需要启动精确的DNA损伤。为了揭示Cas9诱导的DDR事件在活细胞中的序列，已经开发了许多诱导性Cas9系统，它们具有一定的与DDR的快速性、亚细胞相匹配性和时空可诱导性。但是，这些方法通常在工程蛋白中表现出功能不足，时间尺度上是粗略时间控制(因为Cas9在诱导后仍必须先找到靶标)，并且没有空间控制。近日，发表在Science杂志上的一篇文章，报道了一个非常快的CRISPR-Cas9系统(vfCRISPR)，该系统可以按需在亚微米空间尺度和第二时间尺度上进行基因组编辑。他们通过同步双链断裂(DSB)诱导，然后进行互补的生化，测序和基于成像的测定，表征了早期分子事件，这些分子事件是DNA修复启动和进展的基础，时空精度很高。vfCRISPR的设计原理基于化脓性链球菌Cas9(此后称为spCas9)切割机制。原间隔邻近基序(PAM)指导RNA(gRNA)的9至10bp区域，决定了spCas9与靶DNA的结合，而PAM远端区域(10至20bp)的碱基配对切割是必需的。PAM远端区域的错配可防止靶DNA完全解开，并阻止裂解所需的HNH域的构象变化。基于这种机理上的理解，他们用对光敏感的6-硝基胡椒基-氧甲基甲基修饰的脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核酸修饰的核苷酸替换了crRNAPAM远端区域的两个或三个尿嘧啶，当与野生型杂交时形成了一个笼状的gRNA(cgRNA)型反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)。spCas9/cgRNA复合物保留了结合其靶DNA的能力，但无法裂解，因为笼基基团施加的空间位阻会阻止DNA完全解链和核酸酶激活。在或nm处进行光刺激后，笼形基团被去除，spCas9/cgRNA复合物被激活并迅速切割靶DNA。该研究发现vfCRISPR提供了最高的时空分辨率，可以在活细胞中诱导位点特异性DSB。这项研究为进一步结合vfCRISPR与时间分辨的生化，测序和成像读数的DDR进行系统研究奠定了蓝图。将cgRNA与其他基于Cas9的系统(例如切口酶，碱基编辑器和主要编辑器)配合使用，可能分别有助于研究单链断裂，碱基切除或错配以及修复。将vfCRISPR与亚细胞光激活相结合，可以实现具有单等位基因特异性和消除脱靶效应的精确基因组编辑。参考文献：VeryfastCRISPRondemand.LiuY,ZouRS,HeS,NihongakiY,LiX,RazaviS,WuB,HaT.Science.Jun12;():-.doi:10./science.aay.PMID:预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
