1研究背景
自闭症谱系障碍(ASD)是由多种易感基因和环境因素导致神经发育障碍的高度异质性疾病，其主要症状为社交障碍，语言交流障碍和重复性刻板行为。随着高通量测序技术的发展，现已鉴定多种ASD易感基因，已鉴定的易感基因主要富集在更广泛的功能组，包括突触功能，RNA加工，RNA转录调控等功能组。目前，最为关键的信息是每个ASD易感基因在所有可以引发ASD病例易感基因中占比小于1%，表明ASD疾病存在显著的遗传异质性，因而ASD发病机制仍不明确。目前，死后大脑中的皮层神经元仍是ASD候选基因的机制和功能研究材料唯一来源。然而，这些为数不多的ASD患者生物大脑中，其本身含有异质细胞特性，另外，其细胞活力和健康问题也都很难控制。新兴的iPSC技术可以用来研究ASD疾病机制，将人的iPSCs分化为谷氨酸能神经元，可以实现ASD早期神经发育的过程中的异常分子和细胞表型。本研究中，作者结合iPSC技术和CRIPR/Cas9ko技术，构建了多个ASD候选易感基因敲除的同基因型ASD疾病模型系统，实现体外iPSC-神经元模型揭示ASD潜在的发病机制。下面就简单介绍下这篇文章的研究过程。
2研究思路
3研究结果
1.ASD易感基因的选择
研究人员通过WGS测序，筛选了14个候选的ASD易感基因包括ANKRD11,AUST,ATRX,CHD8,AFF2(FMR2),CAPRIN1,CACNA1C,KCNQ2,SCN2A,ASTN2,DLGAP2,CNTNAP2,TENM1(ODZ1)和ANOS(KAL1)（图1A）。这些基因按功能可归类于3个不同的功能组，即RNA转录调控，RNA加工，及突触和粘附功能组。
图1
2.结合iSPC技术和CRISPR同基因型ko技术构建ASD模型系统
首先研究人员通过iPSC技术将正常人外周血在体外重编程为诱导多能干细胞（iPSC），命名为“Ctrl19-2”（图2A-C）。然后构建一个单链59bp的DNA片段（称为StopTag），通过CRISPR/Cas9技术，将StopTag片段引入到Ctrl19-2细胞的ASD易感基因中，实现了10个ASD易感基因的完全敲除（除了ANKRD11,AUST，CAPRIN1和CNTNAP2基因）（图1B）。最后研究人通过神经元素（NGN2）诱导方法，将正常的iPSC和不同的易感基因敲除的iPSCs诱导分化为神经元细胞（图2D），通过膜片钳技术检测，发现这些分化的神经元具有发射重复动作电位的能力(图2E)，以及相似的输入电阻、向内和向外电流的能力（图2F）。
图2
3.iPSC和神经元上验证10个易感基因表达水平
研究人员对敲除的10个易感基因在转录组水平进行验证，发现5个易感基因转录本水平是降低的（图3B）。然而，另外的突触基因CACNA1C、KCNQ2、SCN2A、DLGAP2和TENM1转录水平并没有显著变化（图3B）。尽管有的基因在转录水平没有显著降低，但是westernblot分析证实突变神经元中没有靶蛋白的（图3C），也没有发现截短蛋白（图3D）。这些结果表明，10个易感基因是完全被敲除的。
图3
4.RNA-seq技术分析ASD模型系统分子机制
研究人员首先对正常的iPSC和iPSC-KO进行RNA-seq。iPSC-KO转录谱揭示了，这些属于不同功能组的易感基因，也许调控相同的基因集合表达或信号通路。与对照的iPSC相比，在不同的KOiPSC系中，与“神经元投射”相关的几种不同的GO功能和pathway呈现出相似的特征（图4A）。这表明，可能一些KOiPSC株系的转录组已经倾向于ASD相关变化。
然后，研究人员对分化神经元RNA-seq数据进行挖掘，发现在不同的KO神经元中共有一些差异基因（DEGs）（图4B）。有趣的是，图4B中许多上调的DEGs参与突触构型的cadherin超家族PCDH的成员。与之相反，一些下调的DEGs属于转录因子的C2H2锌指超家族ZNF。
综上，iPSCs和神经元中的差异表达分析表明，共有的信号通路和DEGs富集到突触因子功能中，从而可能影响神经元的功能活动。为了排除遗传背景的影响，研究人员用另一正常的iPSC“50B”进行了验证，结果与“Ctrl19-2”试验一致（图4C）。
图4
5.膜片钳技术和微电击阵列记录系统(MEA)检测神经元电生理表型
研究人员使用膜片钳电生理学来测量神经元的活动，发现ATRX-,AFF2-,KCNQ2-,SCN2A-和ASTN2-神经元的活性是降低的（图5A）。这些数据表明，不同易感基因分类的ASD可以产生相似的电生理表型。另外，使用MEA技术，发现与对照组相比，SCN2A-null神经元的MFR和网络突发频率是显著降低的（图5B）。表明，这些易感基因的突变可以影响谷氨酸能神经元的细胞外自发性网络活动，并在较长时间内在人群水平上减少神经元活动。
总之，这些研究数据表明，ASD易感基因的功能是可以干扰神经元的活性。
图5
4研究意义
CRISPR敲除技术可以获得与ASD患者同基因型的iPSC细胞，进一步分化成谷氨酸能神经元，对比不同易感基因ko后的分子和细胞表型，可以发现不同基因与ASD的关系，发现共性和特性，有助于进一步揭示ASD发病机制。另外，本研究中采用的同基因型CRISPR多基因ko策略结合iPSC技术构建ASD疾病模型系统，在其他类型的多基因及异质性遗传疾病的体外模型构建中也有重要的参考意义。
文献来源：
