中科院神经所杨辉博士于年11月24日在开放获取期刊GenomeBiology上在线发表了论文CRISPR/Cas9-mediatedtargetedchromosomeelimination，介绍如何使用CRISPR/Cas9敲除整条性染色体和常染色体，及其潜在的临床应用。BMC借此机会对杨辉博士进行了采访。
BMC：杨辉博士您好，能否简要介绍一下你们的研究工作，为何要致力于去掉一整条性染色体？
杨辉博士：众所周知，CRISPR/Cas9是一个非常高效的基因编辑工具，这个方法利用特定靶向的单导向RNA（sgRNA）来广泛地应用于基因或基因组领域的编辑工作。
最开始，我们计划应用CRISPR/Cas9来研究Y染色体基因的功能。Y染色体主要用于负责雄性性别分化和生育能力。然而至今，只有一部分基因能通过靶向敲除小鼠而获知其生物学功能。因此，除了Y染色体的单拷贝基因，我们还研究了Y染色体多拷贝基因是否也能被高效的删除，从而研究这些多拷贝基因的功能。
令人惊奇的是，我们发现敲除了多拷贝基因Ssty1,Ssty2andRbmy1a1都会导致雄性胚胎的性别转换。实验数据表明性别反转的原因是由于多拷贝基因的编辑导致整个Y染色体丢失了，而不是因为多拷贝基因的敲除。因此，可以利用靶向染色体多个特定位点的单个sgRNA或者多个分别靶向一个特定位点的sgRNA混合物，在特定的染色体上造成多个DNA切割从而敲除整条染色体，包括X染色体，Y染色体和常染色体。
被敲除了Y染色体的小鼠（即左边的XO小鼠）和正常雌性小鼠（即右边的XX小鼠）一样，拥有雌性生殖器特征。图片来自论文。
BMC：您的研究与前人的研究相比有哪些突破？
杨辉博士：随着CRISPR/Cas9的出现，科学家们正试图将该技术运用到多个领域中去，包括基因删除、基因插入、大片段敲除和染色体易位。然而，整条染色体是否能通过CRISPR/Cas9来敲除依然是个未解之谜。
之前研究表明，通过插入反向的loxP位点到特定的染色体后再通过Cre介导的姐妹染色体重组的方法，或者将一个TKNEO转基因插入靶向染色体的中后由于会发生持续染色体丢失从而通过药物筛选来获得染色体丢失的克隆的方法能够实现特定染色体的去除。这两种方法都需要两步操作，并且获得染色体删除的细胞产量非常少，因此不适合用于体内研究。相反，CRISPR/Cas9介导的染色体去除为获得染色体敲除的动物模型提供了新思路，同时对于人类非整倍体包括多余染色体疾病来说是一种潜在的治疗策略。
BMC：这种技术在临床上有什么应用前景？您能够举例说明这种技术未来可能可以预防的疾病吗？
杨辉博士：染色体非整倍性是一种人类遗传紊乱疾病，由于一条染色体的增加或缺失，会导致在婴幼儿时期就出现明显的发病率和死亡率，包括唐氏综合征（多一条21号染色体），克兰费尔特综合征（多一条X染色体）以及XYY综合征。
利用CRISPR/Cas9介导染色体去除技术，在培养皿中的细胞、胚胎以及更重要的体内组织中选择性的去除多余染色体，这个技术对于治愈非整倍性疾病来说提供了潜在的治疗方案。然而，利用这种方法去除两个同源X染色体中的一条的时候，我们发现剩余的X染色体也发生了突变。我们相信在剩余一条（XXY和XYY综合征）或两条（唐氏综合征）染色体上的突变是可以通过单核苷酸多态性，设计只靶向两条或三条同源染色体中特定的一条染色体的sgRNA来避免这种情况的发生。
染色体非整倍性同样也是癌症的一个标志。CRISPR/Cas9介导染色体去除技术也为肿瘤发生中的非整倍新研究提供了新的方法，同时也为广泛的人类抗肿瘤治疗提供了潜在的治疗方案。
BMC：您能向非专业的读者们解释一下CRISPR/Cas9去除染色体的原理吗？最主要的难点在哪里？
杨辉博士：CRISPR/Cas9就像是一种分子剪刀，可以通过sgRNA的引导定点破坏DNA序列上指定的位置。而染色体本质上就是一串非常长的DNA序列，在这个DNA序列上有一些重复序列，也就是说这种序列每隔一段距离就会出现几下，而如果针对这些重复序列设计sgRNA，那么CRISPR/Cas9就会把一条染色体中所有的这种重复序列通通破坏掉，你可以想象一条线被你剪上好几百刀的样子，这条染色体就会被切到彻底崩溃，超越细胞的修复极限，从而无法正常参与到细胞正常的DNA复制等过程中，随着细胞分裂，这条染色体在子代细胞中也就不复存在了。
这个技术目前的主要挑战在于如何大量引入多个DNA切割。不同的重复序列之间的染色体去除效率不同，并且很难去预测这些重复序列是否工作的很好。另外一个挑战就是如何选择性的去靶向两条或三条同源染色体中的特定一条染色体。
BMC：像CRISPR这样的基因编辑技术会带来哪些伦理上的考验？
杨辉博士：作为基因编辑领域的学者，我们相信这方面的技术未来将在医疗等方面发挥更巨大的作用。同时我们也充分理解现在社会上对于这种技术的伦理担忧，因此我们向来就一直支持并遵守该领域相关的伦理准则，比如在之前的国际干细胞大会上，各国专家通过了对于基因编辑领域的伦理准则，比如不能将基因编辑技术用于编辑人类生殖细胞，不得用于恐怖主义，不得威胁生态安全等等。
CRISPR真正应用于病人还有许多问题有待解决，比如基因编辑效率，导入细胞的方式以及脱靶效应。我们认为所有技术都需要必要的规则来约束，因此我们也愿意与社会各界人士充分交流来保障人类和环境的安全。
作者介绍：杨辉，中科院神经科学研究所PI，于年建立实验室。他在中科院生化细胞所李劲松老师实验室获得博士学位，并第一次建立了小鼠孤雄单倍体干细胞。之后，在MITRudolfJaenisch实验室接受博后训练，第一次将CRISPR技术应用于基因修饰小鼠的建立。他现在实验室专注于优化CRISRP技术并将其应用于猴疾病模型及工具模型的建立。同时，他实验室仍白癜风能够治疗好吗北京中科白殿疯正规吗
