基
因
世间生灵，一花一草，
皆由基因控制。。。
在基因被发现之前，人们一直认为是上帝创造了万物，赋予这个世界丰富多彩、形态各异的生灵。而如今大家都知道，世间生命的多样，都是由基因控制的。基因的本质是一段具有遗传效应的DNA片段，它决定了生物的特征，指导生物体有序地进行生长、凋亡、繁殖等生命活动。
有一种技术悄然而生，它可以对基因随心所欲地进行定点的突变、加入和敲除。这就是风靡全球实验室的基因编辑技术。
基因编辑技术
之前，大家常用的基因编辑技术有ZFN和TALEN，但近几年，CRISPR/Cas系统作为后起之秀，由于其费用低，操作更简便，不易脱靶，可多位点切割等优点，迅速成为生命科学最热门的技术之一。尤其是CRISPR/Cas9系统，可以在包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等物种中有较好的效果。
CRISPR/Cas9系统主要有三种元件：
1
gRNA
gRNA：是根据目标区域设计的与其互补的一段特异性RNA序列，用于识别基因组上的靶基因。
2
Cas9蛋白
Cas9蛋白：是核酸内切酶，当gRNA找到靶基因后，会将Cas9蛋白招募过来，将目标区域切断。细胞会通过非同源末端连接（NHEJ）来修复DNA的断裂，如果只需进行基因的敲除，此时就完成了。
3
ssODN
ssODN：是单链DNA供体，当目标区域产生断裂，细胞还能进行同源介导的修复（HDR），利用供体DNA来修复DNA断裂，就可完成目标基因的敲入。
详细的CRISPR/Cas9基因编辑的原理和机制介绍可查看：CRISPR/Cas9技术开启基因组编辑新纪元
温馨提示：
基因有限公司代理的Lonza-AmaxaNucleofector细胞核转染系统针对难转染的细胞都有较高的转染效率，为您实验室的基因编辑助力。
大体积转染的4D-Nucleofector?LV单元，可一次转染高达10^9个细胞，为临床治疗提供有力的工具。
基因编辑技术就像“上帝之手”一样，能帮我们把这个世界改造得更美好。比如：可以突变目标基因，构建突变体或动植物模型；可以改造免疫细胞，进行白血病或其他癌症的治疗；可以改造有基因突变的生殖细胞，有望孕育健康的婴儿；可以改造造血干细胞，进行艾滋病的治疗。
实验模型建立
相比其他的方法，基因编辑技术对基因的定向改造更加精确、高效、快速，得到的突变可以稳定遗传下去。如RNAi技术是在转录水平进行RNA的干扰，使目标基因的表达下调（Knockdown），但基因下调的效果会随着细胞传代减弱，而基因编辑技术可以在多个物种中进行彻底地基因敲除（Knockout）；DominantNegative方式是通过过表达突变的蛋白来干扰生物体中正常蛋白的功能，而基因编辑技术可建立更纯粹、效果更稳定的基因敲除模型。
通过基因编辑技术，我们可以得到持续稳定的突变体，用于基因功能的研究；建立疾病动物模型，帮助我们进行疾病发病机理和治疗的研究。
癌症治疗
免疫细胞治疗的方法，让人类看到了一线战胜癌症的希望，尤其是CAR-T细胞治疗，近几年来在癌症治疗上大放异彩。这种疗法的原理是从病人血液中收集T细胞并进行体外改造，使T细胞能表达相应的CAR嵌合性抗原受体，从而具备特异识别和杀死相应肿瘤细胞的能力，这样的T细胞称为CAR-T。目前该疗法在急性淋巴白血病、淋巴瘤等恶性血液肿瘤的治疗中效果显著。
CAR-T细胞的获得通常是利用一种逆转录病毒或慢病毒技术将CAR基因转运到T细胞中。但这种运送方法会使得CAR基因随机地插入到这些受体细胞（即T细胞）的基因组中，若插入的位点刚好位于一些重要的基因或癌基因中，可能会引起非常危险的副作用。
美国斯隆凯特林癌症纪念中心（MemorialSloanKetteringCancerCenter）的研究人员通过基因编辑技术，我们可以将CAR基因精确地整合到T细胞基因组的特定位点上，这种精准的方法不仅可以加强T细胞杀死肿瘤细胞的能力，又能降低潜在风险，在病人体内会更加安全。在这项研究中，研究人员使用的是Lonza的X-vivo15培养基培养T细胞，改造后的CAR-T细胞回输病人前，用Lonza的支原体检测试剂盒（MvcoAlertMvcoplasmaDetectionKit）质控。
遗传疾病治疗
许多的遗传疾病是由于某个基因突变使一些重要的蛋白功能缺失或异常造成的，如果能对这些基因突变进行纠正，不就能治疗单基因遗传病吗？比如，对病人造血干细胞和祖细胞的致病基因进行矫正，再回输到病人体内，就能分化出正常的血细胞，用于血液遗传病的治疗；对生殖细胞或胚胎干细胞的致病基因矫正，胚胎就能进行正常的发育，为孕育健康的婴儿提供可能。
斯坦福大学的研究人员运用基因编辑技术对自体造血干细胞进行β-球蛋白基因矫正，治疗镰刀贫血症和β-地中海贫血症。他们提取了患者的造血干细胞和祖细胞，并进行改造和培养，再将千万个改造后的细胞回输患者体内，之后在患者体内发现了正常的红细胞。在这个研究项目中，研究人员先在Lonza-AmaxaNucleofectorμL体系中进行造血干细胞和祖细胞基因编辑的条件摸索，再将成熟的条件直接扩大，用Lonza-Amaxa4D-Nucleofector?LV单元转染8×10^7个细胞，用于患者的治疗。
对于一些单基因导致的严重遗传病，比如肥厚型心肌病、囊肿性纤维化、亨廷顿舞蹈症或者戴萨克斯症，也可以运用基因编辑技术来治疗。俄勒冈健康与科学大学的研究人员将健康女性的卵细胞与肥厚型心肌病（HCM）男性患者的精子结合，通过基因编辑技术对受精卵中的致病基因进行矫正，成功获得矫正的胚胎。他们还将成功矫正的胚胎，针对易脱靶的多个基因进行测序，并未发现脱靶现象。该方法为单基因遗传病的治疗带来了希望。在实验中，研究人员先从HCM患者中获取皮肤成纤维细胞，通过iPS的技术构建iPSC。运用4D-Nucleofector技术将CRISPR-Cas9的组件转到iPSC中，验证基因矫正实验的可行性。
艾滋病治疗
HIV是一种狡猾的逆转录病毒。主要攻击人体的辅助T淋巴细胞系统，一旦侵入机体细胞，就会整合到宿主细胞基因组中，终生难以消除。虽然抗逆转录病毒疗法可以有效的抑制艾滋病毒，但是却不能根除这些整合性病毒。
利用基因编辑技术，针对HIV病毒设计导向分子，招募来的核酸酶会对HIV病毒基因进行特异的剪切，从而可以永久抑制它的复制。这一技术也被证明对细胞是安全的，没有毒副作用。
另一方面，科学家发现，HIV病毒侵入人类T细胞，与细胞表面的CCR5蛋白息息相关，因为少数的北欧人由于CCR5基因“变异”，具备天然的HIV抵抗力。利用基因编辑技术对艾滋病患者的造血干细胞进行CCR5基因的突变，再回输给病人，有望让病人能持续产生抗HIV的T细胞。
怎样提高基因编辑的效率呢？怎样高效地把CRISPR系统的元件转运到细胞中？特别是原代细胞，免疫细胞，干细胞等难转染的细胞。请期待我们下次的分享……
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