背景
由于过度激活淋巴细胞介导的体内分泌细胞因子，噬血细胞淋巴组织细胞增生症（HLH）是一种罕见的，复杂的，危及生命的高炎症状态。原发性HLH由于遗传缺陷导致，遗传缺陷主要发生在儿童期并且与早期新生儿死亡相关。继发性HLH由继发感染引发，可在任何年龄发生。
案例介绍
本报告提出了两例HLH病例。病例1是一名3个月大的男孩，父母属于二级近亲，临床上怀疑患有HLH。PRF1基因2号外显子发生致病性变异[c.GC（p.TrpSer）。父母是杂合子携带者，而患儿是纯合的。母亲再度怀孕后证实胎儿是杂合子携带者。案例2是一名半岁的男孩，父母为非近亲结婚。根据HLH-修订的诊断指南（符合5/8标准）怀疑其有患有HLH。检测发现SH2D1A基因内含子1发生半合子致病变异c.-3CG.，母亲和妹妹都是携带者。
结论
该研究代表了两种罕见的HLH患者有PRF1错义变异和SH2D1A基因剪接位点变异的病例。详细的分子诊断帮助家庭在随后的怀孕期间进行精确的遗传咨询和产前诊断。提倡可以对出现EBV相关HLH的男性患者进行XLP筛查，这可能会对早期诊断和治疗意义（如果有的话）。
噬血细胞淋巴组织细胞增多症（HLH）是一种罕见，复杂且危及生命的综合征，其特征是由于淋巴细胞过度活化而在体内释放分泌性细胞因子导致的过度炎症。不同种族的18岁以下患者的HLH总体估计患病率约为每,人1例。HLH分为两种，原发性（P-HLH），其中遗传缺陷是潜在的原因。P-HLH通常以常染色体隐性遗传模式遗传，并且主要在儿童时期观察到导致早期死亡。继发性或获得性HLH由于病毒感染，自身免疫/风湿病，恶性或代谢病症而被触发，并且在所有年龄组中均可见。
原发性HLH进一步分为两组：家族性HLH（FHL）和淋巴组织增生性疾病。FHL的全球发病率尚不清楚。然而，在瑞典进行了关于FHL的广泛研究，并且发现其估计发生率为50,个活产婴儿中的1个。FHL综合征被细分为FHL-1至FHL-5，这取决于所涉及的基因和功能蛋白的改变。FHL具有常染色体隐性遗传，并在近亲家族更常见。在早期疾病过程中可以看到噬血细胞增多症的突出特征。它很少发生在继发性HLH中，或者可能在疾病发展后期观察到。
原发性和/或继发性HLH的诊断是根据组织细胞学会的临床表现或分子发现或两者进行的。据报道，近58%的FHL病例存在PRF1基因突变（位于10q22.1），这改变了穿孔素的正常功能;而40%-60%的X连锁淋巴组织增生性疾病在SLAM相关蛋白（SAP）调节基因SH2D1A（位于Xq25）中具有突变。在个致病突变PRF1基因，并在99个致病性突变SH2D1A基因已在文献中迄今报道，包括来自印度的14HLH病例归因于基因突变在PRF1基因。我们在这里报告两例HLH，其中每个都有PRF1和SH2D1A基因突变。
案例1
一个年轻的二度近亲父母由于肝肿大伴有全血细胞减少症，因为他们的第二个孩子（P1）在3个月大的时候到期，因此被转介进行第三次孕妇的遗传咨询。Proband的姐姐很正常。先证者出生时足月，出生体重3.3公斤。新生儿时期平安无事。在3个月大的时候，他首次发生高级间歇性发烧，过度哭闹，烦躁和口服摄入减少三天。一般检查显示心动过速和呼吸急促。在腹部检查中，肝脏在锁骨中线可触及4厘米，坚固且结节一致。血液学检查显示全血细胞减少症（血红蛋白：9.5g/dl，白细胞减少症：WBC/cmm，血小板计数55,/cmm）。生化参数升高[血清ALT：U/l，AST：U/l，铁蛋白（ng/ml），甘油三酯（mg/dl），凝血酶原时间（PT）22s和活化部分促凝血酶原激酶时间（APTT）50s]。血清纤维蛋白原减少（mg/dl）。超声检查显示肝肿大，轻度右侧胸腔积液和轻度肝下液收集。骨髓检查显示细胞骨髓有反应性变化。基于此，先证者在临床上怀疑为HLH。
图1先证者的谱系图（P1）
从外周血分离基因组DNA，并在Hiseq-IlluminaNGS平台上处理噬血细胞淋巴组织细胞增生基因组。检测到染色体10q22.1上PRF1基因（OMIM*;NM_.5;NP_.1）的外显子-2中的纯合突变体变体c.GC（p.TrpSer），如图2所示。该变体导致在密码子（ENSP00398568）上的色氨酸上的丝氨酸取代。计算机分析工具如突变测试仪，SIFT，Polyphen2预测了所述变体的破坏作用。该变体未在0基因组数据库中报道并且发现是有害的（rs）。双向Sanger测序进一步证实亲本对于相同的变体是杂合的[c.GC（p.TrpSer）PRF1基因外显子2。所有这些研究证实了FHL2的常染色体隐性遗传。绒毛膜绒毛（CVS）的产前诊断在妊娠12周进行，其揭示了PRF1基因的外显子2中c.GC变体的杂合状态。正常的携带儿童在足月正常分娩时分娩。
图2分子遗传学分析（一）的示意性表示PRF1上chr10q22.1基因位置，并报告纯合变体c.GC/p.TrpSer在PRF1基因（b）的母序列色谱图（杂c.GC/p.TrpSer在PRF1基因中）（c）父亲的序列色谱图（杂合子c.GC/p.TrpSer在PRF1基因中）（d）胎儿的序列色谱图（杂合子c.GC/p.TrpSer在PRF1基因中）
案例2
男孩（P2;5号孕妇）出生时足月，出生体重2.25公斤。产后期间平安无事。他出生于非近亲的年轻父母。图3。早些时候，先证者的大哥由于早产而在4天时去世。第二个兄弟在3岁时死亡，与指数病例有类似的抱怨，有两个健康的老年正常姐妹（14岁和11岁）。由于高ALT（IU/ml）和乳酸水平，先证者的母亲的兄弟在3岁时早逝。先证者在16个月时被主诉发生持续发烧（15天持续时间）并且有一次局灶性癫痫发作，面部抽搐（持续2-3分钟）在其内部消退3天。在17个月时，先证者因病毒性疾病入院。身体检查显示出轻微的水肿面部。在腹部检查时，肝脏在中锁骨线处可触及3厘米，坚固和结节的一致性。脾脏2厘米可触及脐部，坚固和结节一致。没有观察到面部畸形。
图3先证者的谱系图（P2）
血液学调查显示外周血伴有全血细胞减少症（血红蛋白：6.9g/dl，白细胞减少症：WBC/cmm，血小板计数减少3/cmm）。生化参数升高[血清ALT：U/l，凝血酶原时间（PT）20s和活化部分促凝血酶原激酶时间（aPTT）58s]。由于发烧和惊厥的病史进行脑脊液检查，并提示临床说明中提到的无菌性脑膜炎。EBV通过血清学检测检测为阳性。骨髓检查显示细胞骨髓抽吸具有足够的红细胞生成，骨髓增生，毒性变化，网状纤维适度增加，轻度嗜酸粒细胞增多和足够的巨核细胞提示反应性骨髓改变。然而，有证据表明在环钻骨髓活检中存在噬血细胞增多症。超声检查显示腹腔内有轻微的脾肿大，中度肝肿大和游离液最少;肾脏，胰腺，胆囊和主动脉旁区域并不显着。大脑MRI显示脑膜脑炎伴有感染后广泛脱髓鞘，所有肺叶（额颞-枕叶-枕叶），脑室周围白质，基底神经节，丘脑，脑干和小脑半球的双侧受累;没有新鲜梗塞，占位性病变（SOL），出血，脑实质畸形。大脑MRI显示脑膜脑炎伴有感染后广泛脱髓鞘，所有肺叶（额颞-枕叶-枕叶），脑室周围白质，基底神经节，丘脑，脑干和小脑半球的双侧受累;没有新鲜梗塞，占位性病变（SOL），出血，脑实质畸形大脑MRI显示脑膜脑炎伴有感染后广泛脱髓鞘，所有肺叶（额颞-枕叶-枕叶），脑室周围白质，基底神经节，丘脑，脑干和小脑半球的双侧受累;没有新鲜梗塞，占位性病变（SOL），出血，脑实质畸形。进行了生化研究，排除了Gaucher和Niemen-Pick-A疾病。β-葡萄糖苷酶，血浆壳三糖苷酶，酸性鞘磷脂酶也正常。鉴于未知来源的发热（PUO），肝脾肿大，全血细胞减少，高甘油三酯血症，高铁蛋白和噬血细胞增多，怀疑HLH并根据Henter-修订的诊断指南（5/8标准）进行临床确认。由于脑膜脑炎，先证者在19个月时死亡。
图4先证者的MRI图像（P2）可以看到具有感染后广泛脱髓鞘的脑膜脑炎
通过从外周血中分离基因组DNA进一步确认诊断，该基因组在Miseq-IlluminaNGS平台上进行临床外显子组测序，该平台已在内含子中鉴定出半合子可能致病变体c.-3CG-1个SH2D1A基因（OMIM*490;NP_.1;NM_.4;图5）。计算机模拟预测工具（ASSP）进一步支持该变体的影响影响外显子-2的剪接位点并引起蛋白质的移码终止（p.Arg47GlyfsTer34）（80个氨基酸残基而不是个氨基酸残基）。MutationTaster认为该变种是致病的。在ExAC或0基因组数据库中未发现此变体。执行双向Sanger测序以验证其存在。对先证者的母亲和妹妹进行了研究，发现SH2D1A基因的内含子1中的c.-3CG突变是杂合的。
图5分子遗传学分析（a）SH2D1A基因在chrXq25上的位置示意图和报道的变体c.-3CG/p.Arg47GlyfsTer34在SH2D1A基因的内含子1中。（b）母体的序列色谱图（SH2D1A基因的内含子1中的杂合子c.-3CG/p.Arg47GlyfsTer34。（c）妹妹的序列色谱图（杂合子c.-3CG/p.Arg47GlyfsTer34inSH2D1A基因的内含子1
讨论和结论
PRF基因突变（N=33/）跨越多个种族。它们在亚洲和欧洲的人口主要是观察美国和其他人群。无义突变（p.Trp34Ter）主要见于土耳其人口，移码突变（c._delCT和c.50delT）在日本和非裔美国人口而错义突变（p.Ala91Val和p.TrpSer）分别见于意大利和印度人口。在PRF1基因的保护下观察到HLH中常见的大多数错义突变。尽管如此，SH2D1A基因突变没有报道这种种族偏好。
在我们的研究中，先证者P1在PRF1基因中具有上述致病突变（p.TrpSer）。该基因编码穿孔素蛋白，位于10q22.1区域，对于自然杀伤细胞（NK细胞）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的颗粒释放机制是强制性的，通过在靶细胞的质膜中形成孔并用于被动扩散。颗粒酶B的凋亡事件。从出生到1岁，这种蛋白质在CD8+细胞中表达高达0-3%，而在1岁至15岁的淋巴细胞中，CD56+细胞表达1%至30%。在我们的案例P1中，PRF1中的错义突变p.TrpSer基因很可能导致蛋白质结构的糖基化位点增加，导致细胞内钙离子的结合稳定性丧失。这使得穿孔蛋白成为非功能性通过在构象，引起有缺陷已经在多数FHL患者中观察到NK细胞活性的变化。虽然目前的研究缺乏NK细胞活性缺陷的功能证据，但Schneider等。根据NK细胞活性水平将FHL患者分为四种亚型。另一方面，PRF1基因中纯合无义突变的病例均未显示出与FHL亚型无关的NK细胞活性的证据。这表明PRF1突变可能在FHL病例中持续存在缺乏NK细胞活性中起重要作用。
Katano等人已证实PRF1错义突变患者中有未穿透的前体形式的穿孔素和活性成熟形式的穿孔素的积累。这表明PRF1基因的错义突变导致蛋白质的构象变化并抑制穿孔素前体的蛋白水解切割。FHL患者的免疫能力取决于抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能分析。PRF1基因错义突变患者的细胞毒性形成与无义突变相比仍然完整。尽管如此，抗原特异性CTL的功能分析可以更好地洞察患者的免疫能力。
在先证者P2中，检测到SH2D1A基因的内含子1中的致病半合子变体（c.-3CG）。Sayos等人早先在一个6岁的意大利男孩身上报道了相同的变体。该基因编码SAP蛋白，位于Xq25位置。它是三种正常免疫功能的细胞NK-T（自然杀伤T）细胞、T细胞和B细胞的关键调节剂。在胸腺来源的淋巴细胞中观察到SAP表达增加。SLAM-SAP相互作用引发淋巴细胞活化。突变c.-3CG影响外显子2的剪接位点，导致SAP的移码终止并导致功能失调。这改变了SH2结构域，其在与SLAM分子的结合中起关键作用。因此，功能失调的SAP蛋白诱导T淋巴细胞的信号转导并显示其调节缺陷。这种缺陷可能会导致干扰素-γ的产生受损，辅助T细胞（CD4+T细胞）导致病毒复制增加。
一个正面的EpsteinBarr病毒检测标志着免疫系统在防止EBV感染方面的失败，这是由于有缺陷的HelperT细胞消除了EBV感染的B淋巴细胞，这很可能是由于NK缺陷造成的了细胞活化和NK细胞介导的细胞毒性。Parolini等人提出的模型表明，2B4分子（SLAM家族成员）的功能改变会影响控制体内EBV感染的能力。作者还表明，在没有SAP/2B4介导的识别的情况下，CD48在抑制NK细胞介导的EBV感染的B细胞杀伤中起关键作用。Benoit等还表明SAP/2B4信号改变导致免疫功能障碍。杀死EBV感染细胞的免疫系统失败导致细胞毒性细胞的长时间活化并导致细胞因子分泌，激活了巨噬细胞，降低了血细胞计数和血红蛋白水平，导致骨髓中的噬血细胞增多和肝功能紊乱，这在本次报告的病例中可以观察到。表明基因变体影响免疫功能，但在病毒感染后，XLP变得危及生命。
据报道，具有剪接位点变异的XLP1患者平均发病年龄为2岁，预计存活3年，与我们的观察结果一致。这表明由于基因变异导致的SAP缺乏导致淋巴细胞的严重激活并对患者产生深远的影响。此外，我们还还注意到具有无义突变和缺失突变的XLP患者具有降低的SAP，而错义突变和剪接位点突变没有降低的SAP表达。未接受特定治疗或接受移植治疗的患者死亡主要是由于严重的全血细胞减少导致免疫功能失调。此外，据报道，对于真菌，细菌或病毒感染，未经治疗的患者存活时间2个月。
总之，我们的研究分别报道了PRF1和SH2D1A基因突变，已知这些基因与HLH有关。详细的分子诊断分析能帮助家庭在随后的怀孕期间进行精确的遗传咨询和产前诊断。同时，我们还建议对出现EBV相关HLH的男性患者进行XLP筛查，以便进行早期诊断和治疗意义。
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