中华耳科学杂志,年17卷6期
TLR4基因敲除小鼠对噪声性耳蜗损伤的反应
杨卫平许阳胡博华杨仕明强噪声暴露引起耳蜗损伤，导致听觉功能障碍。噪声暴露后耳蜗免疫系统被激活，产生炎性介质和免疫细胞渗入[1-4]。然而，耳蜗免疫激活的分子机制尚不清楚。本课题组前期采用RNA序列分析技术研究发现，噪声暴露后大鼠、小鼠耳蜗感觉神经上皮主要表达相同的基因包括免疫应答、创伤、防护、趋化和炎性反应等基因，及趋化因子、NOD样受体、Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）等信号通路基因[5]。
TLR家族共有13个成员，主要承担识别感染性疾病中“病原体相关分子模式”(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMP)和非感染性疾病中坏死的细胞释放“损伤相关的分子模式”（damageassociatedmolecularpaternals,DAMPs）因子，TLR与相应的配体相结合后通过级联信号传导引起细胞免疫炎症反应[6,7]。Toll样受体4（Toll-likereceptor4，TLR4）是Toll样受体家族中的成员，是固有免疫系统中最重要的致炎信号通路之一，主要分布于免疫细胞和具有免疫功能的细胞[8]。TLR4与配体结合后启动相关通路，导致多种炎性因子的释放[9]。我们的前期研究发现TLR4蛋白表达于内耳细胞，噪声暴露后内耳细胞TLR4蛋白表达增强[10]。
本实验选用TLR4基因敲除(TLR4KO)小鼠，观察Toll样受体4缺失小鼠耳蜗对噪声刺激的反应，分析其作用的机制。
1材料和方法
1.1实验动物
本实验采用C57BL/6J小鼠（野生型,WT,对照组）和B6.B10ScN-Tlr4lps-del/JthJ小鼠（TLR4基因敲除型,TLR4KO，实验组）4～5周龄，雌雄各半，购自杰克逊实验室(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME,USA）。小鼠的使用得到美国布法罗大学实验动物中心的许可。
1.2实验步骤
首先检测小鼠听功能，筛选对照组动物，评估实验组动物听力学基线。噪声暴露后1天,CO2麻醉后动物断头处死（每组各4只)，观察CD45标记的噪声暴露后小鼠耳蜗基底膜鼓阶面巨噬细胞及单核细胞形态的变化。噪声暴露后25天，听功能检测（每组各7只)后动物处死，鬼笔环肽染色耳蜗基底膜毛细胞丝状肌动蛋白，计数耳蜗基底膜缺失的外毛细胞。
1.3听功能检测
使用美国TDT测听设备（Alachua,FL,USA)检测小鼠ABR阈值。听功能检测在屏蔽的隔声间内进行。噪声暴露后25天，腹腔注射氯胺酮（87mg/kg）和赛拉嗪（3mg/kg）麻醉动物，将成功麻醉后的小鼠置于保温毯上保持恒定体温。记录电极放置于小鼠颅顶皮下，参考电极放置于小鼠测试耳的耳后皮下，接地电极放置于小鼠非测试耳的耳后皮下。四个频率(4kHz、8kHz、16kHz和32kHz)的短纯音诱发小鼠两耳ABR阈值，重复率为21次/秒。带通滤波为～Hz，叠加次数为次。刺激的强度从dBSPL开始，以5dB间隔递减至ABR图形的消失，重复最低dB测试的ABR图形。
1.4噪声暴露
将美国TDTRP2.1信号发生器（TDT,USA)、PA5信号衰减器(TDT,USA)和美国CrownXLS信号放大器(HarmanInternationalCompany,USA)发出的噪声信号传至美国NSD-8扩音器(Emi?nence,USA)。选用宽带1-7kHz，强度dBSPL的强噪声对WT和TLR4KO实验组小鼠持续噪声暴露1小时。噪声暴露过程在隔声室内进行，将小鼠放置于小铁笼内，扩音器悬挂于鼠笼之上。噪声暴露前，使用美国LD-PCB,modelB声级计(APCBPiezotronicsDiv.,LarsonDavis,USA)、LD-PCBmod?el前置放大器(LarsonDavis,USA)和LarsonandDavis电容式微音器(LDL,USA)校准噪声暴露区域声场的强度。
1.5耳蜗毛细胞丝状肌动蛋白染色
噪声暴露前和噪声暴露后25天，听功能检测后处死动物，解剖取出双侧耳蜗。自圆窗缓慢注入10%福尔马林液，室温固定耳蜗组织4小时。采用本项目组建立的原位耳蜗基底膜毛细胞丝状肌动蛋白染色观察法[10]，染色评估强噪声暴露后耳蜗毛细胞形态学的变化。
1.6免疫细胞的荧光标记
采用免疫细胞的CD45荧光标记方法染色小鼠耳蜗基底膜[3]。噪声暴露前和噪声暴露后1天，解剖取出小鼠双侧耳蜗，将固定后分离的耳蜗基底膜移入10mMPBS稀释的免疫荧光蛋白CD45一抗液中(goatCD45polyclonalantibody1:,AF,RDInc.,USA)4°C孵育过夜。PBS液清洗后将耳蜗基底膜移入PBS稀释的Fluor?二抗液中(AlexaFluor?donkeyanti-goatIgG,1:,Invitrogen)室温孵育2h。PBS液清洗后将标本置入10mMPBS配制的5μg/ml碘化丙锭(propidiumlo?dide,Molecularprobe,OR,USA)液中，室温避光染色10min，抗荧光退变剂(ProlongTMAntifadekit,MolecularProbesInc.USA)封片。
1.7显微镜观察及图像处理
使用Leica荧光显微镜(Z6APOManualMacro?Fluo,USA)观察AlexaFluor鬼笔环肽染色的耳蜗基底膜毛细胞和CD45荧光免疫抗体标记的耳蜗基底膜鼓阶面的组织巨噬细胞和单核细胞。利用SPOTRT显微镜配制的相机(ColorDiagnosticIn?struments,MI,USA)依次拍照全耳蜗基底膜，采用AdobePhotoshopCS6计算机图像处理软件(version13.0.1,SanJose,CA,USA)将连续拍照的图像合图。观察噪声暴露后1天耳蜗基底膜鼓阶面组织巨噬细胞和单核细胞形态变化，噪声暴露后25天耳蜗基底膜毛细胞形态变化，计数全耳蜗基底膜图像中缺失的外毛细胞。
1.8统计学处理
实验数据的统计分析采用美国SigmaStatVer?sion3.5软件处理，各组数据以x±s表示。比较噪声暴露前WT和TLR4KO小鼠四个频率ABR阈值，及噪声暴露后25天两组小鼠ABR阈移，采用两因素方差分析。比较噪声暴露前及噪声暴露后25天两组小鼠全耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目，采用t检验分析，P0.05为具有统计学意义。
2结果
2.1生理条件下Toll样受体4基因敲除没有影响小鼠耳蜗基底膜感觉细胞的生存
荧光显微镜下观察，Alexa-labeled鬼笔环肽染色的生理条件下WT和TLR4KO小鼠耳蜗基底膜毛细胞结构正常，偶见毛细胞缺失（见图1A和B)。比较WT（14.3±3.4)与TLR4KO（15.3±3.9)小鼠全耳蜗缺失外毛细胞数目无显著性差异（t检验，P=0.,见图1C)。
2.2噪声暴露后TLR4KO小鼠听功能下降幅度小于WT小鼠
噪声暴露前检测TLR4KO与WT小鼠听功能正常，两组动物ABR阈值无显著性差异(F=0.,df=1,,P=0.;Tukeytest,P0.05)，见图2A所示。噪声暴露后25天听功能检测发现，四个频率短纯音诱发的TLR4KO小鼠ABR阈移均明显低于WT小鼠对照组(F=71.,df=1,90,P0.;Tukeytest,P0.)，见图2B所示。
2.3噪声暴露后TLR4KO小鼠耳蜗外毛细胞损伤程度轻于WT小鼠
荧光显微镜下观察，鬼笔环肽染色的强噪声暴露后两组小鼠耳蜗基底膜顶回外毛细胞损伤程度较轻（见图3A和C），耳蜗底回为外毛细胞缺失的主要部位（见图3B和D）。两组动物耳蜗缺失的外毛细胞数目比较显示，噪声暴露后25天TLR4KO小鼠全耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目明显少于WT小鼠对照组(图3E，F=8.,df=1,17,P=0.;Tukeytest,P=0.)。
2.4TLR4基因缺失没有阻止噪声暴露后单核细胞渗入耳蜗
在生理条件下，WT和TLR4KO小鼠耳蜗顶回和底回基底膜鼓阶面可见CD45染色阳性的巨噬细胞(多形型，Fig.4A,C,E,G)。噪声暴露后1天，两组小鼠耳蜗基底膜顶回和底回巨噬细胞形态无明显变化（Fig.4B,D,F,H),但在两组小鼠耳蜗底回基底膜与外侧壁连接处均可见CD45染色阳性的单核细胞（小圆型，Fig.4F和H），表明TLR4基因缺失没有阻止噪声暴露后单核细胞浸入耳蜗基底膜。
3讨论
我们的前期研究发现，耳蜗基底膜鼓阶面存在固有组织巨噬细胞，暴露后1天出现单核细胞浸入耳蜗基底膜[3]。本实验检测暴露后1天TLR4KO小鼠耳蜗基底膜免疫细胞形态变化，目的揭示TLR4基因缺失是否影响单核细胞浸入耳蜗基底膜。暴露后25天检测外毛细胞的数量，目的是评估TLR4基因缺对耳蜗外毛细胞形态的作用。我们对WT和TLR4KO小鼠耳蜗外毛细胞计数及ABR阈值检测结果发现，生理情况下TLR4基因敲除并未影响小鼠耳蜗毛细胞形态和听觉功能，表明TLR4基因与正常听觉功能无关。暴露后1天，WT和TLR4KO小鼠均出现耳蜗基底膜单核细胞的浸润,表明TLR4基因敲除并未影响噪声暴露后血液中单核细胞向耳蜗基底膜鼓阶面的浸润。
本实验的主要目的为揭示TLR4基因敲除对噪声性耳蜗感觉细胞损伤、听觉功能障碍和耳蜗免疫活力的影响。采用TLR4KO小鼠模型，以WT小鼠为对照，观察强噪声暴露后25天耳蜗外毛细胞缺失数目和ABR阈值的变化。发现强噪声暴露后，TLR4基因敲除减少噪声暴露后小鼠耳蜗外毛细胞死亡数量，减轻听功能损伤程度，表明TLR4参与了噪声暴露后耳蜗外毛细胞的损伤，其可能机制：高强度噪声暴露后耳蜗毛细胞的机械性损伤继发代谢性损伤和免疫炎性反应[11]。耳蜗外毛细胞对强噪声性耳蜗损伤最为敏感，强噪声暴露后耳蜗外毛细胞主要以凋亡和坏死方式死亡[12]，细胞凋亡是噪声性耳蜗毛细胞死亡的主要方式[13]。凋亡细胞由于细胞内溶酶体膜完整，死亡后被吞噬细胞吞噬，很难造成周围细胞的损伤[14]。坏死细胞内溶酶体膜破裂，释放大量多种酸性的水解酶，造成坏死细胞的自溶和周围细胞的炎性反应[15]。同时，坏死的细胞释放多种DAMPs因子，DAMPs与固有免疫功能细胞上的“模式识别受体”（patternrecogni?tionreceptors，PRRs）结合，进而激活固有免疫系统，直接或间接启动适应性免疫应答[16]。我们的前期研究发现，高强度噪声致耳蜗毛细胞的死亡发生在噪声暴露后数分钟内[12]，并可延续至噪声暴露后30天[13]，表明强噪声暴露后耳蜗毛细胞存在明显的次级损伤。因此，本实验选择观察强噪声暴露后25天TLR4基因敲除小鼠耳蜗毛细胞形态和听觉功能的变化。本课题组前期研究证实，本实验采用的噪声暴露条件（宽带1-7kHz、dBSPL、噪声暴露1小时）能造成小鼠听功能障碍，出现永久性听力阈移(permanentthresholdshift,PTS)[17]。
我们的前期实验发现，TLR4蛋白表达在耳蜗感觉神经上皮中毛细胞临近的支持细胞，噪声暴露后1天过表达的TLR4集中在死亡毛细胞周围的Deiters细胞[10]。另有研究报道，TLR4表达在耳蜗柯蒂氏器与外侧壁螺旋韧带之间的外沟细胞[18]。
本实验形态学检测发现，噪声暴露后TLR4KO小鼠耳蜗基底膜外毛细胞损伤程度明显轻于WT对照小鼠，结合噪声暴露后TLR4蛋白过表达于死亡毛细胞周围的检测结果，我们认为TLR4促进噪声性耳蜗毛细胞的损伤。
能够与TLR4相结合的DAMPs主要有热休克蛋白(HSPs)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、组蛋白(Histones)、S蛋白(Ss)等[7]。有研究报道，强噪声暴露后4小时小鼠耳蜗组织HSP的表达量为未接触噪声暴露小鼠的20余倍[19]。作为DAMPs之一的HSP能与耳蜗免疫功能细胞膜上TLR4相结合，激活免疫功能细胞，诱导促炎因子的产生。本实验采用免疫细胞荧光抗体CD45染色耳蜗基底膜发现,噪声暴露后1天TLR4KO和WT小鼠耳蜗基底膜底回均出现单核细胞浸入。我们的前期实验证明，噪声暴露后4天，浸入耳蜗基底膜的单核细胞开始转化为巨噬细胞[3]。从时间上分析，噪声暴露后早期TLR4参与的耳蜗免疫反应主要由耳蜗基底膜固有组织巨噬细胞和免疫功能细胞执行。参与耳蜗免疫反应的细胞主要包括免疫细胞如巨噬细胞（固有型和游走型）、单核细胞[3]，和具有免疫功能的非免疫细胞如：柯蒂氏器的支持细胞、外侧壁的纤维细胞和耳蜗基底膜鼓阶面的间皮细胞[1]。目前有研究发现，柯蒂氏器中的支持细胞是产生炎性因子的一个重要来源[10]，螺旋韧带的纤维细胞产生多种炎性因子[20-21]。噪声暴露后TLR4与配体结合激活免疫功能细胞，激活的免疫功能细胞释放炎性因子，导致耳蜗细胞的炎性反应和听功能的下降。本实验噪声暴露后TLR4KO小鼠耳蜗外毛细胞缺失数量减少，听功能下降程度减轻，表明TLR4的缺失对噪声性耳蜗毛细胞损伤起到了一定的防护作用。
总之，本文发现TLR4缺失减轻噪声暴露后耳蜗基底膜外毛细胞的损伤，表明TLR4促进噪声暴露后耳蜗的炎性反应。我们认为噪声机械性耳蜗毛细胞坏死导致DAMPs的释放，DAMPs与耳蜗具有免疫功能的支持细胞和纤维细胞膜上的TLR4结合，激活免疫功能细胞，诱导促炎因子的释放，导致耳蜗细胞免疫炎性反应。TLR4的缺失部分阻断炎症过程，降低促炎因子的表达，减轻噪声暴露后耳蜗感觉细胞和听功能损伤的程度。TLR4作为启动机体先天性免疫应答的开关，在噪声性耳蜗损伤中起着重要的作用。然而，噪声暴露后耳蜗死亡的细胞释放哪些DAMPs?TLR4与DAMPs结合后释放哪些促炎因子？促炎因子如何作用到毛细胞？诸多问题有待于进一步研究揭示。深入探讨TLR4在噪声性耳蜗损伤的免疫炎性机制，将成为临床早期干预的研究方向。
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